流感病毒实验室检测

1、流感监测目的 （一）监测流感活动水平和流行动态； （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。 流感监测内容 （一）流感样病例监测 （二）流感样病例暴发疫情监测 流感样病例监测标本采集 采集对象： 流感样病例流感样病例 发热（体温发热（体温3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集时间：病人发病的头3天内采集 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家 哨点医院每周至少采集515份流感样病例的 标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时 调整） 暴发疫情标本采集 （1）1周内，在同一学

2、校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。 采集标本类型 常规常规特殊特殊 咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻拭子鼻拭子 鼻洗液 痰液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本 采样液 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或 MEM； 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入

3、抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ） 咽拭子采集 咽拭子咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料 杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉 签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃 去，旋紧管盖。 标本的保存与运送 标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室 未能送至实验室的，应置-70或以下保存， 一周内送实验室 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室 实验室生物安全要求 l季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级 实验室进行。 l流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必

4、须在生物 安全级实验室的生物安全柜里操作。 l用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全级实验室进行 标本的接收 接收标本时必须核对送检表 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统” 标本的处理 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测 程序实时调整） 实验室检测 核酸检测 病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养 胶体金快速检测 检测流程 临床标本采集临床标

5、本采集 接种接种MDCK细胞细胞接种鸡胚接种鸡胚 红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 红细胞凝集试验红细胞凝集试验 寄送国家流感中心寄送国家流感中心 流感病毒核酸检测阳性流感病毒核酸检测阳性 核酸检测 核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 4）将Viral RNA

6、Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 5）重复步骤4。 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。 荧光定量PCR 第一次使用前引物稀释 1引物工作浓度（

7、40M） 配制方法： （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量 为9.1 nmol ，加水量为109.191l） （3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。 2探针工作浓度（10/20M/） 配制方法： （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100M，

8、可作为储存液。 （3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。 荧光定量PCR 引物和探针 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； 涡旋振荡引物和探针； 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的试剂 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保 持低温。 荧光定量PCR 反应体系和条件 试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One

9、-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen， 货号：11732-020或11745-100） 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) 正反向引物 (40M) 双重标记探针(10M) 反应条件：逆转录50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反应体系为25ul 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号 （FAM） 荧光PCR结果阳性样品 荧光PCR结果阴性样品 荧光PCR结果可疑样品 病毒分离-MDCK细胞 3335培养 接种流程 清洗MDCK 细胞 临床采样标本接种细胞 Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍 3335度吸附12小

10、时 Hanks液清洗细胞 加入病毒生长液，3335度培养箱培养 24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融12次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ） 根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临 床标本 流程图 MDCK细胞病毒分离 lCPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关 l每日观察细胞病变(CPE) l标

11、本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA 试验阴性者，继续盲传12代后，HA试验 仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴 性，标本可弃去 细胞病变图 鸡胚病毒分离 检卵 标本准备 鸡胚分离方法-试剂准备 1) 1) 9 91111日龄鸡胚日龄鸡胚 2) 2) 照蛋灯照蛋灯 3) 70%3) 70%7575酒精酒精 4) 1ml 4) 1ml 一次性注射器一次性注射器 5) 5) 鸡蛋开孔器鸡蛋开孔器 6) 6) 无菌胶布或蜡无菌胶布或蜡 7) 10ml 7) 10ml 试管和试管架试管和试管架 8) 10ml 8) 10ml 移液管或移液管或1ml1ml移液器及无菌吸尖移液器及无菌吸尖 9)

12、9) 无菌镊子无菌镊子 10) 10) 无菌眼科剪无菌眼科剪 鸡胚分离方法-标记鸡胚 检视标记鸡胚 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部 的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育 不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉 接种病毒方法接种病毒方法 单腔接种 盲种 双腔接种 灯下接种 开窗接种 鸡胚分离方法鸡胚分离方法 鸡胚分离流程（1） 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚

13、 用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10 x6mm 窗口 用注射器吸200l处理过的临床标本，装上16 号针头 从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100l标本。将针头退出至 寸，将另外100 l标本 注入鸡胚尿囊腔 鸡胚分离流程（2） 用同一注射器和针头将同一标本依上法接种 另外的两枚鸡胚 将针头弃于合适的生物安全装置中 用消毒过的医用胶布封口 3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床

14、采样 标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚 生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非 特异死亡应弃去 鸡胚分离流程（3） 收获尿囊液和羊水收获尿囊液和羊水 鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时 标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 用70%75酒精消毒鸡胚顶部 用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊 膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收 集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水 放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个 鸡胚的羊水合并 鸡胚病毒鉴定 l 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继 续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡

15、胚 病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获HA试验 病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验 病毒鉴定流程 红细胞凝集试验 4个凝集单位配制“回滴” 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验（HA） l MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚 鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病 毒滴度 l 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含）含 有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂 蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有 这两种成分。因

16、此流感病毒能与其结合并识别，产这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产 生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素 结合后，可以抑制凝集现象出现结合后，可以抑制凝集现象出现 红细胞红细胞鸡鸡火鸡火鸡豚鼠豚鼠人人 O 型 血 红型 血 红 细胞细胞 马马 适用范围流感和禽流 感病毒 流 感 和 禽 流感病毒 流感病毒流感病毒禽流感病毒 终 浓 度 （） 0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.5（1%） 孔底部形 状 U或V型U或V型U型U型U型 孵育时间30min30min

17、45min45min60min 细胞对照细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状 细 胞 沉 积 成圆点状， 倾 斜 时 细 胞 向 下 流 成泪滴状 细胞沉积成 环状 细胞沉积成 环状 细胞沉积成 环状 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul50ul50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒 加入配制好 的红细胞悬 液 充分混匀， 置室温孵育 30-60分钟 观察记录结 果 病病 毒毒 原原 液液 1：2 1：128

18、HA： 32 HA128 HA： 4 红细胞凝集试验（HA） lHA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI） 试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK 细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴 度8后，再进行HI测定 l若传12代后，HA滴度仍8者，可应用核 酸检测方法进行鉴定 红细胞凝集抑制（HI）试验 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供 的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B （Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标 准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI） 试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试 验时，需同时进行4种标准抗原对照。 红细胞凝集抑制试验步骤 4个凝集单位的配制

19、和检测 稀释血清 加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30 分钟 每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温 孵育30-60分钟 观察记录结果 4个凝集单位的配制和检测 4个凝集单位的配制 读取红细胞凝集试验的结果 计算所须的4个凝集单位的病毒用量 用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8， 所得商即为4个单位的稀释度 用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单 位 用50ul，前4孔完全凝集 。此时的抗原即为4个 凝集单位 红细胞凝集抑制试验稀释血清红细胞凝集抑制试验稀释血清 12765349810 H1 血清 50ul H3 血清 50ul 50ul PBS B 血清 50u

20、l 25ul PBS 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul B 血清 50ul H3 血清 50ul H1 血清 50ul 流感病毒的型别判定 标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价 20才可以算为阳性 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种 以上的标准血清抑制 待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制， 但与一种标准参照血清抑制效价大于其他 参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的 流感病毒 红细胞凝集抑制试验-质量控制 使用的试剂可靠无误 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 读取HA试验的结果是否正确 4个血凝单位是否准确 红细胞阴性对照 待鉴定病毒确保没有被细菌

21、污染 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确 结果录入 流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒 分离后，24小时内将病毒分离结果录入“监 测信息系统”中的“病毒分离、鉴定结果 登记一览表” 中 。 毒株的送检 系统自动生产的送检单，省里和国家均送 检 时限要求 包装要求 2012年年 底底 50%省省CDC 建成省级流建成省级流 感参比中心，感参比中心， 70 %网络实网络实 验室开展病验室开展病 毒分离毒分离 90%省省CDC 建成省级建成省级 流感参比流感参比 中心，中心，90 %网络实验网络实验 室开展病室开展病 毒分离毒分离 2015年底年底 省级参比中心 开始启动 9个（30%）省级C

22、DC建成省级流感参比 中心80 %网络实验室开展病毒分离 2009-2013年度全国网络实验室工作开展情况年度全国网络实验室工作开展情况 62 199 248 297 327 199 151 101 68 1 13 111213 0 100 200 300 400 500 2009年年4月份前月份前2009-2010年度年度2010-2011年度年度2011-2012年度年度2012-2013年度年度 网网 络络 实实 验验 室室 （ 家家 ） 开展病毒分离的Lab仅开展核酸检测的Lab未开展工作的Lab 80.1% 70 75 80 85 90 95 100 0 100 200 300 40

23、0 500 2010年年2011年年2012年年2013年年 正正 确确 率率 （ % ） 网网 络络 实实 验验 室室 数数 （ 家家 ） 未参与考核的家数考核结果有误的lab 考核结果全部正确的lab全部正确率（%） 2010-2013年度全国网络实验室盲样考核情况年度全国网络实验室盲样考核情况 97.5%93.2% 96.0% 2010-2013年度全国网络实验室标本检测结果年度全国网络实验室标本检测结果 32600 28679 27852 30120 2803727239 4738 12632 12728 0 10000 20000 30000 40000 2010-2011年度201

24、1-2012年度2012-2013年度 标标 本本 数数 （ 份份 ） 阳性的标本数阳性的标本数进行亚型鉴定的标本数进行亚型鉴定的标本数分离毒株数分离毒株数 省级流感参比中心工作要求省级流感参比中心工作要求 至少每月编撰至少每月编撰1次监测数据分析报告，在疫情流行次监测数据分析报告，在疫情流行 期每周编撰期每周编撰1次监测数据分析报告次监测数据分析报告，并上报。，并上报。 监测数据分析监测数据分析 定期培训和现场指导相结合；定期培训和现场指导相结合； 每年组织对本省至少每年组织对本省至少30%的流感监测网络实验室及的流感监测网络实验室及 哨点医院进行督导检查哨点医院进行督导检查，督导报告上报备

25、案。，督导报告上报备案。 培训培训和督导和督导 中国疾控中心每年中国疾控中心每年对对省级流感参比中心省级流感参比中心和和抽查抽查的的1-2家网络实验室家网络实验室 进行流感盲样标本考核进行流感盲样标本考核； 省级流感参比中心每年考核本辖区内所有网络实验室；省级流感参比中心每年考核本辖区内所有网络实验室； 每年组织对辖区内的流感监测网络成员单位进行质量评估每年组织对辖区内的流感监测网络成员单位进行质量评估 考核和评估考核和评估 省级流感参比中心工作要求省级流感参比中心工作要求 4年内，使本省所有流感网络实验室均具备有病毒分离能力；年内，使本省所有流感网络实验室均具备有病毒分离能力； 本省至少有本

26、省至少有2/3的网络实验室每年送国家流感中心的毒株数的网络实验室每年送国家流感中心的毒株数 不少于不少于30株。株。 实验室监测实验室监测 逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐药性分析逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐药性分析 能力，相应结果报送至中国疾控中心；能力，相应结果报送至中国疾控中心； 序列数据提交全国流感监测网络基因序列共享数据库。序列数据提交全国流感监测网络基因序列共享数据库。 实验室监测实验室监测 负责对本辖区内网络实验室季节性流感毒株在负责对本辖区内网络实验室季节性流感毒株在10个工作日个工作日 内进行复核鉴定内进行复核鉴定； 对对HA（血凝）滴度（血凝）滴度8

27、的毒株利用的毒株利用HI方法进行复核鉴定方法进行复核鉴定； 对对HA8的毒株进行核酸分型的毒株进行核酸分型/亚型鉴定亚型鉴定； 每周一每周一反馈反馈上周复核结果。上周复核结果。 实验室监测实验室监测 参比中心近期要求参比中心近期要求 成为参比中心4年内，所有流感网络实验室 均具备病毒分离能力，并上送毒株 省参比中心的毒株复核鉴定工作 各实验室毒株在网上送检时需要多点一下送省里 毒株 国家流感中心 省CDC 10个工作日内 完成复核鉴定 滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一 在系统中反馈结果 质控考核-考核标本 考核标本制备： 14份H1N1，14份H3N2，14份 BV， 10份 H5N1，7份H7N9，10份阴性 7份BY和H3N2混合型 4份H1N1，H3N2，BY混合型 每个地市随机抽取5份标本 质控考核-新的要求 增加混合型 B型要求分系 考虑到运输问题，均为强阳性 质控考核-结果 14家网络实验室结果全部正确 一些问题： 原始记录应为手写，而非全部打印原始记录应为手写，而非全部打印+签名签名 原始记录空白项、涂改项原始记录空白项、涂改项 有一地市为非正式的报告单，报告人未签有一地市为非正式的报告单