流式细胞分析技术

1、流式细胞仪分析技术及应用第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术第三节 流式细胞仪技术要求 一、检测样品制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、胶乳颗粒的应用 四、流式细胞技术的质量控制第四节 流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节 流式细胞术在临床检测中的 主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 二、染色体分析 三、细胞表面标志的检测 1、淋巴细胞及其亚群的分析 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血 病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测

2、中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。流式细胞术主要包括： 1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、

3、数据的采集和分析技术流式细胞术发展史: 1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenb

4、erg研制出细胞分选器 1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂 大量厂家不断生产流式细胞仪 目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司流式细胞术的特点：流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量主要特点 ：单个细胞水平分析； 多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析； 高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快： 5

5、000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况； 分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。 第一节 概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。流式细胞仪分为三大类：一类为台式机（临床型）：BD FACSCalibur流式细胞仪特点：1、仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。 2、两激光配置：488nm 633nm 3、 检测参数：四荧光参数 两个散射光参数 4、分析型流式细胞仪5、应

6、用：细胞分析检测第二类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。第三类为新型流式细胞仪：随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4 根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。BDFACSAria流式细胞仪：高速分析分选流式细胞仪； 高速分析 ； 高速分选； 3根激光： 488nm 、 633nm、375nm结合特制

7、高性能石英杯流动室； 应用：细胞分析分选、 sp细胞检测流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核-特异性抗原粒度细胞活性DNA, RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子, PH值, 膜电位酶活性一、 流式细胞仪的基本结构：一般分为5 部分： 流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束成形系统； 光学系统； 信号检测、存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统。 概括为三个系统结构：（1） 液流系统（2） 光学系统（3） 数据处理系统光学测量台电子控制台数据采集、储存和计算机处理。光学测量台：完成光学信号测量和转换电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成

8、数据信号数字信号最后送入电子计算机里储存处理 输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。1、液流系统由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli 方程： P=(1/2)PV （勿略高度的变化）真空

9、泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一个恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。2、激光源和光学系统激光光源：采用气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管（PMT）：FSC, SSC（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）激光光源与光束成形系统大多采用氩离子气体激光器：激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快

10、速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为2266m 即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90角方向照射，细胞产生散射光和荧光。光学系统由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3 类：1、长通滤片：

11、（long-pass filter, LP） ：LP500滤片允许500m 以上光通过，而500m 以下光吸收或返回。2、短通滤片（short-pass filtr, SP） ：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500m 以下光通过，500m 以上光吸收或返回。3、带通滤片（band-pass filter, BP） ：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75m-525m。3、数据处理系统: 主要由计算机及其软件分析系统组成二、流式细胞术的工作原理 采用激光作为激发光源，

12、保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 细胞分选：高精度分选，纯度达90%-99%（细胞活性不受影响） 基本过程 图A流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜物镜、光学放大统计计算机，5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数1、参数测量原理（1）、散射光的测量 散射光信号不依赖任何样

13、品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为: 前向散射光（forward scatter,FSC）（0散射） 侧向散射光（sidescatter,SSC ）（90散射） 。 散射光信号波长与激光相同。前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，

14、用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 （2）、荧光信号（FL）测量 当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号： 一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号； 另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信

15、号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。 通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1 、FL2进行检测和定量分析，了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同，可以显示不同的荧光颜色如红色、绿色、蓝色等。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管（PMT）。 一般有两类放大器：线性放大器和对数放大器荧光染料的特性：

16、激发波长(EXCITING)、 发射波长(EMISSION)常用荧光染料: 常配置的激光器波长为488nm 通常采用染料： 碘化丙锭 (propidium iodide，PI)、 PI 630nm 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、PE 575nm 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC） FITC 525nm PE-CY5 等。 633nm激光器常用染料有 APC APC-Cy 荧光信号的线性测量与对数测量： 主要由电子线路来完成 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT

17、），PMT 将光信号转换成电信号。 电信号输入到放大器放大，放大器分两类： 线性放大和对数放大 线性放大器：即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 荧光信号的面积和宽度 所谓荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA 含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA 的含量，当形状差异较大，而DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。 荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集

18、，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。 光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素（如PE 和FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。 要克服这种误差的最有效方法是使用荧光

19、补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。 各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC，PE 的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC 受激后多数将光源转变为525nm 左右的光；PE 多数将其转变为575nm 左右的光。 同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。（3）、细胞样品分选原理通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液

20、滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。（一）分选基本原理 图B 分选收集装置： 微管 1275mm 15ml管 微孔板分选： 可以用24/96/384/1500微孔板进行微孔分选。 检测指标： 阳性百分率； 绝对计数； 平均荧光强度（二）FCM 分选指标 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至

21、少达5 000 个秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。 分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比（4）、 数据处理分析原理 参数：FSC,SSC,FL 数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种数据显示方式： 单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 设门分析技术 目前FCM 数据存贮

22、的方式：采用列表排队（list mode）方式 目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为410000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。（一）、 参数： FSC：反映颗粒的大小； SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少（二）、数据显示方式直分析方图： 单参数直方图； 双参数直方图:点图、 二维等高图

23、、 假三维等高图；三参数直方图； 多参数分析设门分析: REGION和GATE设置a 单参数直方图由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。 如图表示细胞DNA单参数直方图，横坐标表示荧光信号强度，纵坐标代表所检测的细胞数。b 双参数直方图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常

24、用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少 在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体； X 坐标为该细胞一参数的相对含量 Y 坐标为该细胞另一参数的含量。 在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。第三节 流式细胞仪技术的要求 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 一、样品制备细胞样品制备要求： 1、单细胞悬液； 2、细胞最适密度0.5106-1.5106个/ml； 3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底

25、； 4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色； 5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。FCM的检测范围细胞结构= 细胞大小= 细胞粒度= 细胞表面面积= 核浆比例= DNA含量与细胞周期= RNA含量= 蛋白质含量细胞功能= 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原= 细胞活性= 细胞内细胞因子= 酶活性= 激素结合位点= 细胞受体一、检测样品制备 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：机械法（金属网引起细胞破碎）；酶处理法（选择最适宜消化

26、酶）；化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）；表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存：深低温保存法（一年）；乙醇或甲醇保存法（2周）；甲醛或多聚甲醛保存法（2月注意事项： 1、新鲜组织标本应及时进行处理保存； 2、根据实验目的选择最隹的固定方法； 3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。 4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞； 5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔

27、组织的肿瘤食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。二、常用的荧光染料与标记染色适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示： F=Q(I-eCL) F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时

28、，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。1、要选择正确的激光器： 不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发： FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质；如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等定量荧

29、光染色的评价标准 特异性，荧光染料和所研究的细胞成是否特异性结合； 荧光强度与检测的细胞成分呈严格的正相关关系； 使用荧光显微镜检查，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否一致，并可看到一个粗大的荧光颗粒； 用 FCM 分析评价，以DNA 含量分析为例，在组方图上第一个峰（G0/1 细胞峰）与第二个峰（G2M 期细胞）是否成倍数关系。能量传递复合染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。（二）免疫荧光标记 荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价

30、键结合荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记三、免疫胶乳颗粒技术的应用免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。四、流式细胞技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等） 试剂选择 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等） 实体组织来源标本用

31、机械法 温度2537，pH7.07.2（二）免疫荧光染色的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂三）仪器操作的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。（四）免疫检测的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第四节、流式细胞仪的科研应用1、细胞表型分析 2、胞内蛋白的检测 3、细胞周期和DNA倍体分析 4、流式标准小球

32、定量 5、分选 6、细胞内钙离子测量 六、流式细胞术的临床应用1、细胞周期和DNA含量分析2、细胞凋亡的检测和分析3、血小板及血小板活化的FCM 分析4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测5、白血病细胞免疫分型1、DNA 含量分析 检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。 用BrdUrd 脉冲标记（pulse-labelling）细胞及其抗体的使用或结合连续标记 BrdUrd 和Hoechst33258 染料则可以观察细胞循环过程中的一动态变化过程。DNA

33、倍体分析的理论依据： 在生物细胞中，DNA 含量是比较恒定的参量，但DNA 含量随着细胞增殖周期各时相的不同而发生明显的变化。 G0 期细胞：不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞DNA 含量为较恒定的2C 值，G1 期细胞与G0 期细胞DNA 值相同，均为二倍体DNA含量，当细胞DNA 倍增结束，进入G2 期，最终进入M 期，在M 期分裂为两个子细胞之前，G2 和M 期细胞的DNA 含量均为恒定的4C 值，即为四倍体细胞群。 荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比； 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比； 荧光脉冲

34、与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分： 即G0/1、S、G2M G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。 在癌组织DNA 直方图上显示：异倍体DNA峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。 流式细胞术分析肿瘤细胞 DNA 倍体时，应根据DNA 直方图、G0/1 峰位和DNA 指数（DNA index, DI）来确定DNA 倍体类型。 在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、

35、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义 DNA分析诊断肿瘤： 1、DNA非整倍体细胞峰2、突出的四倍体细胞峰 DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的

36、交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标2、细胞凋亡的检测和分析 细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（programmed cell death ,PCD），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程（见图2-5-1）。细胞凋亡分析 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的主要检查手段 形态学检测 Ladders实验 流式细胞术检测 与凋亡相关的病理过程 HIV 自身免疫性疾病 肿瘤细胞凋亡的主要指标 细

37、胞内酶改变：Caspase-3活化 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白： Fas Bcl-2（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）Caspases-3 又称半胱氨酸蛋白酶3，是细胞凋亡信号传导通路中的ICE 蛋白酶家族的重要成员，在细胞凋亡发生的早期被激活,临床常用caspase 3来检测早期的细胞凋亡。（2）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：Annexin V-FITC/PI 法： 在细胞凋亡的早期PI 不会着

38、染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术 双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA 广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表现，也为FCM 鉴别细胞凋亡奠定了物质基础。目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰（见

39、图2-5-4）。2、淋巴细胞亚群分析 检测原理：利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。 最常检测的亚群包括T 细胞（CD3）、B 细胞（CD19）、NK 细胞（CD16+56）、辅助性T 细胞（CD3+CD4+）和抑制性T 细胞（CD3+CD8+）等。 应用实例：MultiSET 系统利用CD14/CD45 设门技术精确检测淋巴细胞亚群比例。 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数T淋

40、巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+) 根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。Simu

41、lTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒 CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 g1/g2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色 CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞 CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞临床意义 了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥

42、反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测3、白血病和淋巴瘤免疫分型 正常白细胞在其分化过程中，随着系列的不同、成熟阶段的差异，会在细胞 膜表面表达不同的分化抗原。白血病细胞则在癌变的过程中，丧失了正常细胞底 系列专一性和分化阶段规律性，在本质上有别于正常骨髓细胞。应用此特点可进 行免疫表型分析，以鉴别各种白血病和淋巴瘤，辅助临床诊断、评估疗效和预后。 常用的抗原包括：CD3、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD10、HLA-DR、 CD13、CD14、CD33、CD34、GLY-A、MPO等等。 应用实例：利用CD45三色分析急性髓性白血病。4、残余白血病检测残余白血病是指经过适当的治疗、疾病缓解后仍残留在病人血中的极少量白血病细胞。通常白血病病人经过化疗后的疾病复发率为60-80%，经过自体或异体骨髓移植后的复发率仍偏高（20-50%）。依照不同的白血病，选用不同的抗体组合（如下表）来检测残余白血病白血病种类 可选择的抗体组合T-ALL cyto CD3/TdTB-ALL CD13/TdT，CD33/TdTPre-B-ALL cyto /TdTAML CD13/TdT， CD33/TdT， CD7/TdT5、网织红细胞分析 网织红细胞计数是骨髓红细胞造血功能的重要指标。传统手工计数