叶绿素荧光及分析技术

1、叶绿素荧光与分析技术叶绿素荧光与分析技术 郑彩霞郑彩霞 光合作用与叶绿素荧光光合作用与叶绿素荧光 在光合膜上，有在光合膜上，有2到到10%的吸收光能以的吸收光能以PSII荧光的形式释荧光的形式释 放出来。而放出来。而PSI发射的荧光量很小并且是恒定的，这里没有发射的荧光量很小并且是恒定的，这里没有 进行考虑。进行考虑。 活体状态下，叶绿素荧光几乎全部来源于活体状态下，叶绿素荧光几乎全部来源于PS II 的的Chla（包括天线（包括天线Chl a），活体叶绿素荧光提供），活体叶绿素荧光提供 的快速信息仅仅反映了的快速信息仅仅反映了PS II对激发能的利用和耗散对激发能的利用和耗散 情况情况. 光

2、合作用过程的各个步骤密切偶联，因此任何光合作用过程的各个步骤密切偶联，因此任何 一步的变化都会影响到一步的变化都会影响到PS II从而引起荧光变化，也从而引起荧光变化，也 就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用 过程的变化过程的变化. JUNIOR PAM （Pulse Amplitude Modulated Pulse Amplitude Modulated FluorescenceFluorescence，PAMPAM） JUNIOR PAM的主要操作过程的主要操作过程 暗适应叶夹暗适应叶夹 光适应叶夹光适应叶夹 调制叶绿素荧光技术作为测定

3、植物光合作用调制叶绿素荧光技术作为测定植物光合作用 最简便有效的技术，在国际生物学界多个领最简便有效的技术，在国际生物学界多个领 域得到了非常广泛的应用，如研究植物胁迫、域得到了非常广泛的应用，如研究植物胁迫、 衰老、筛选突变体等。衰老、筛选突变体等。 PAMPAM技术与荧光淬灭的饱和脉冲分析结合是技术与荧光淬灭的饱和脉冲分析结合是 目前测定植物光合作用的标准技术目前测定植物光合作用的标准技术 叶绿素荧光仪工作原理叶绿素荧光仪工作原理 用于激发荧光的测量光具有一定的调制用于激发荧光的测量光具有一定的调制 （开（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧

4、光， 因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包 括背景光很强时。括背景光很强时。 ，打开一个持续时间很短（一般小于，打开一个持续时间很短（一般小于1 s） 的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制）， 从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。）可被看作是光化光的一个特例。 光化光越强，光化光越强，PS II释放的电子越多，释放的电子越多，PQ处累积的电子处累积的电子 越多，也就是说关闭态的电子门

5、越多，越多，也就是说关闭态的电子门越多，F越高。当光化越高。当光化 光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用） 的强度时，就称之为饱和脉冲。的强度时，就称之为饱和脉冲。 Saturation Pulse Method of Quenching Analysis JUNIOR PAM技术参数技术参数 蓝色蓝色LEDLED，标准强度，标准强度0.1 mol m-2 s-1 PAR0.1 mol m-2 s-1 PAR。 ：蓝色：蓝色LEDLED，光强范围，光强范围0 01500 mol m-2 s-1PAR1500 mol m-2 s-1PAR（

6、光纤与样品间的距离为光纤与样品间的距离为1 mm1 mm时）。时）。 蓝色蓝色LEDLED，最大饱和闪光强度，最大饱和闪光强度30003000 mol m-mol m- 2 s-1PAR2 s-1PAR。 LEDLED，730 nm730 nm。 长长40cm40cm，直径，直径1.5 mm1.5 mm。 FoFo、FmFm、Fv/FmFv/Fm、FtFt、FmFm、FoFo、qPqP、qNqN、NPQNPQ 和和rETRrETR等等 由暗适应和光适应下叶片光化学淬灭由最大到最小引起的 （Fm-Fo和Fm-Fo）。 由不产生光化学淬灭和达到最大光化学淬灭（Fm-Fm和Fo- Fo）的光淬灭引起

7、的。 在饱和脉冲光发射之前，在Fm和Fo之间的区域内，诱导曲线上， 它表示PS反应中心的关闭程度。 JUNIOR PAM测量参数测量参数 （Relative Fluorescence Yields） Fm：关闭所有关闭所有PSPS反应中心的高光强脉冲激发的最大荧光值。反应中心的高光强脉冲激发的最大荧光值。 Fm= Fo + Fv。 Fo ：固定荧光或初始荧光产量，也称基础荧光。代表不参与固定荧光或初始荧光产量，也称基础荧光。代表不参与 PS 光化学反应的光能辐射部分，是光化学反应的光能辐射部分，是PS 反应中心处于完反应中心处于完 全开放时的荧光产量，它与叶绿素浓度有关。全开放时的荧光产量，它

8、与叶绿素浓度有关。 Fv ：可变荧光产量，代表可参与可变荧光产量，代表可参与PS 光化学反应的光能辐射光化学反应的光能辐射 部分，反映了部分，反映了PS 原初电子受体原初电子受体QA 的还原情况。的还原情况。 Fo Fo 维持维持PSPS反应中心打开的低光强激发的最小荧光值。反应中心打开的低光强激发的最小荧光值。 Fo：光处理中的最小荧光值：在光处理中的最小荧光值：在Fo-Mode中，中， FoFo荧光在饱和脉冲之后发出，暗适应是荧光在饱和脉冲之后发出，暗适应是PSPS受受 到远红光激发快速转运光系统间的电子，因此开到远红光激发快速转运光系统间的电子，因此开 启启PSPS反应中心。反应中心。

9、Fo Fo=1/(1/Fo-1/Fm+1/Fm=1/(1/Fo-1/Fm+1/Fm) ) FmFm：饱和光脉冲诱导期：饱和光脉冲诱导期PSPS反应中心暂时关闭时反应中心暂时关闭时 的最大荧光值。的最大荧光值。 F F：F F值是光处理期间打饱和脉冲光之前荧光曲线值是光处理期间打饱和脉冲光之前荧光曲线 上的点的取值。上的点的取值。 JUNIOR PAM测量参数测量参数 continued （Fluorescence Quenching Coefficients） PS最大光化学消耗和有效光化学消耗 Y()衡量激发能用于光化学的量。 这两个参数都是衡量PS反应中心那部分能量的。qp建立在单个的PS

10、天线分子 的概念上，而qL假设天线分子之间彼此联系，更接近于叶片内真实情况。这两个 参数的测定不需要使用暗适应样品进行荧光测定，Fo按照Oxborough和 Baker(1997)方法经过计算得到。 这两个参数都与类囊体基质中依赖pH和玉米黄素产生过程的激发能的非光化学淬 灭相关。与以前的荧光系数比较，qN和NPQ的计算总要测定样品暗适应和光适应 条件下的荧光。 对于集合光合天线分子，Y（NPQ）可以定量激发能通过光保护机制散失的能量： 其他非光化学能量称为Y(NO)。最后，光化学和非光化学耗能之和为1： Y()+Y(NPQ)+Y(NO)=1 根据ETR=PARETR-FactorPPS2/P

11、PPSY()计算。 为计算ETR，WinControl-3使用JUNIOR PAM内部脉冲激发辐射装置得到 PAR值。在其他光照条件下，不使用PAR带入ETR计算。 测量程序指暴露在光强持续增加的活化光下的测定程序。通常，每 个光强的时间间隔对于光合反应完全达到平衡太短。因此，将这中光曲线称为“快 速光曲线”（Rapid Light Curves， RLC），它说明当前光合的状态，不能和经典 光合光相应曲线相混。 JUNIOR PAM测量参数测量参数 continued JUNIOR PAM测量参数测量参数 continued 蓝色LED，标准强度0.1 mol m-2 s-1 PAR。 ：蓝色LED，光强范围01500 mol m-2 s-1PAR（光纤与样 品间的距离为1 mm时）。 蓝色LED，最大饱和闪光强度3000 mol m-2 s-1PAR 。 LED，730 nm。 PIN-光电二