限制性内切酶酶切位点保护碱基培训讲学

1、限制性内切酶酶切位点保护碱基精品文档寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求， NEB采用了一系 列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双 酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点 靠近 DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端 至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 - 32PATP在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260

2、单位的寡 核苷酸。取 1 g已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20C条件下分 别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要求而定）。 20%的 PAGE （7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率 则可能因为出现发夹结构而降低。DNA 合成，新链的延伸方向是 53 因此，需要在 5 端加上酶切位点 ,因为内切 酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的

3、碱基提供一个 platform 让它可以结合上去，否则会掉下来 . 引物的结构就是（ 5 3）：保护 碱基 + 酶切位点 + 原来的引物序列收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选 （ 小虾米酶切位 点分析 ） 。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CC ACATGT GG109090CCC ACATGT GGG129090Asc IG

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