分子医学实验：分子医学技能-实验二-

1、分子医学技能分子医学技能- -实验实验二二 Kary MullisKary Mullis l PCR技术最早由美国技术最早由美国 Cetus公司人公司人 类遗传研究室类遗传研究室Kary Mullis及同事于及同事于 1985年发明并研制成功的。年发明并研制成功的。 l Kary Mullis因发明了因发明了“聚合酶链式聚合酶链式 反应反应”而获得而获得1993年度诺贝尔化学年度诺贝尔化学 奖。奖。 PCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 完整的完整的PCR反应体系包括：反应体系包括：模板模板： 单、双链单、双链DNA均可，不能混有蛋白酶、核酸均可，不能混有蛋白酶、核酸 酶、酶、DNA聚合酶

2、抑制剂、聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。相相 对于分子克隆、酶切、连接、标记等，对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对对 DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是模板纯度的要求并不严格。模板用量也是 很低的，一般认为很低的，一般认为102104拷贝模板就可以满足拷贝模板就可以满足 要求。要求。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。 模板浓度模板浓度 过高会导致反应的非特异性增加。过高会导致反应的非特异性增加。 平台效应及其原因平台效应及其原因 染色体多态现象染色体多态现象 蛋白质多态现象蛋白质多态现象 DNA多态现象多态现象 n单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换单个核

3、苷酸的点突变即核苷酸的替换 n单一单一DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失 n整串整串DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失 n基因转换基因转换 w RFLP(restricted fragment length polymorphism) w RAPD(random amplified polymorphic DNA) w 微卫星多态性微卫星多态性(microsatellite polymorphism) w SSCP(single strand conformation polymorphism) w DSCP(double strand conformation polym

4、orphism) w DNA芯片芯片(DNA chips) w DNA指纹指纹 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA标记标记(RAPD) 由由Williams等于等于1990年创立。其基本原理与年创立。其基本原理与PCR技术一致；技术一致； 由人工随机合成的由人工随机合成的DNA 分子为引物，以基因组分子为引物，以基因组DNA 为模板，为模板， 进行多态性进行多态性DNA片段的随机合成。对扩增产物进行电泳、染片段的随机合成。对扩增产物进行电泳、染 色分析，就可直接在紫外光线下看到新合成的色分析，就可直接在紫外光线下看到新合成的DNA分子片段分子片段 形成的不同条带。形成的不同条带。 遗传材料的基

5、因组遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生如果在特定引物结合区域发生 DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位 点的分布发生相应的变化，导致点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生产物增加、缺少或发生 分子量变化。若分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生产物增加或缺少，则产生RAPD标记。标记。 不同品种鸡基因组的不同品种鸡基因组的RAPD分析图分析图 关于关于apoB基因基因 n独立于独立于2号染色体短臂末端，编码号染色体短臂末端，编码apoB蛋白蛋白 质质 n全长全长43kb(28个内含子，个内含子，

6、29个外显子）个外显子） napoB基因基因DNA多态性或遗传变异多态性或遗传变异 高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心梗、冠心高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心梗、冠心 病、肥胖病、肥胖 napoB基因只要有微小变异（缺陷）都可以引基因只要有微小变异（缺陷）都可以引 起高胆固醇和高甘油三酯血症起高胆固醇和高甘油三酯血症 实验分组，认清试剂（每实验分组，认清试剂（每2人一小组，人一小组，一人做乙肝病毒一人做乙肝病毒PCR） 一人做一人做apoBD) 患者血清患者血清40 l + 40 l DNA 提取液提取液，混匀（，混匀（2大组做一份）大组做一份） 沸水浴沸水浴10min，10000rpm5min（离心机的使用）（离心机的使用） 取上清取上清2 l（或（或阳性血清阳性血清2 l）加入一加入一PCR反应管反应管 6000rpm10s，混匀，混匀 PCR仪上，仪上，933min 预变性预变性 (Hema PCR仪的使用与程序设计仪的使用与程序设计) 9345s，5535s，7260s，重复，重复30个循环个循环 72保温保温5min，-20保存备用保存备用 实验操作实验操作 apoB (用个人基因组用个人基因组DNA为模板）为模板） 2*混合液混合液12.5 l 引物引物2l DNA模板模板4 l 蒸馏水蒸馏水6.5l 总体积：总体积：2