乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A

1、乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌 A 549 细胞侵袭力的抑制作用作者：陈志涛 田辉1 岳韦名 1 李林1 亓磊1 朱应超 1 作者单位： (山东大学附属济南市中心医院胸外科，山东 济南 250013)【摘要】目的 探讨乙酰肝素酶 (heparanase，HPSE )反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide，ASODN) 对人肺癌 A549 细胞侵袭力的抑制作用。方法 设计合成互补于 HPSE mRNA 起始密码区的 HPSE ASODN，以阳离子脂质体 Lipofectin 包埋后转染人肺癌 A549应(RTPCR)方法检测肺癌A549 细胞HPSE 蛋白及其

2、mRNA表达的变化 ;以 Matrigel 细胞侵袭试验对HPSE ASODN 对肺癌 A549 细胞侵袭的抑制进行检测。 结果 ASODN 各组与正常对照组和脂质体组比较及 ASODN 各组间比较 HPSE mRNA 和蛋白的表达及细胞侵袭力均受到明显抑制(P0.01);ASODN 在终浓度为 100、200、400nmol/L 时对肺癌 A549 细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%和 91.2%。结论 HPSE ASODN 通过下调 HPSE mRNA 和蛋白的表达可显著抑制肺癌 A 549 细胞的侵袭力，并呈剂量依赖性。【关键词】 肺肿瘤 ;乙酰肝素酶 ; 反义寡核苷酸Inh

3、ibition of invasiveness of human lung cancer cell lines by heparanase antisense oligodeoxynucleotideCHEN ZhiTao，TIAN Hui ，YUE WeiMing ，et al.Department of Thoracic Surgery，Jinan Central HospitalAffiliated to Shandong University ，Jinan 250013，Shandong，China【 Abstract】 Objective To evaluate the inhibi

4、tory effect of HPSE antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on the invasiveness of humanlung cancer A 549 cell lines.Methods HPSE ASODN which was complementary with initiation codon region of HPSE mRNA wasdesigned and synthesized.After embedded by cation lipofectin，it was transfected into A 549 cells

5、 of human lung cancer.The expression of HPSE protein and HPSE mRNA in A 549 cell lines were detected by flow cytometry and RT PCR.Meanwhile Matrigel invasive assay was used to measure the inhibitory effect of HPSE ASODN on the invasiveness of human A 549 cell lines.Results The HPSE protein and HPSE

6、mRNA expression and invasiveness of human A 549 cells treated with ASODN of different concentrations were significantly decreased as the ASODN concentration increasing.There was a significant difference between control group and each group of ASODN respectively(P0.01)，between lipofectin group and ea

7、ch group ofASODN respectively(P0.01)，and among the groups of ASODN (P0.01).Besides，the difference of inhibitory effect was significant among the cells treated with different ASODN concentrations(P0.05)。2.2 RTPCR 检测 ASODN 对 HPSE mRNA 表达抑制作用半定量 RT PCR 扩增产物电泳结果 (图 1，表 1)显示：正常对照组和脂质体对照组之间比较， HPSE mRNA 表

8、达量差异不显著 (P0.05); 随着 ASODN 浓度的增加， HPSE mRNA 表达依次下降， ASODN 的抑制作用具有明显的剂量依赖性。 ASODN 各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN 各组间 HPSE mRNA 表达比较差异显著(P0.05);随着 ASODN 浓度的增加， HPSE 蛋白表达的 FI 依次减小且呈明显剂量依赖性 ;ASODN各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN各组间比较差异显著(P0.01)。表1 HPSE ASODN 对A549 细胞HPSE 蛋白及其侵袭力的影响与正常对照组和脂质体组比较：1)P0.01;与 ASODN 100 n

9、mol/L 组比较： 2)P0.01;与 ASODN 100、200 nmol/L 组比较： 3)P0.05);随着ASODN 浓度的增加，侵袭细胞数依次减少，ASODN 各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN 各组间侵袭细胞数比较差异显著 (P0.01);ASODN 对细胞侵袭力的抑制作用呈明显剂量依赖性(表 1)。即 ASODN 在终浓度为 100、200、400 nmol/L 时对 A549 细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%、91.2%(图 2)。图 2 不同浓度 HPSE ASODN 组 A549 细胞穿透基底膜的侵袭细胞数 (HE,400)3 讨 论早在 1

10、975 年 H k 等就发现一种降解 HS 侧链的内切糖苷酶，并首次对此酶的活性进行了描述。此后， Hulett2等克隆出了人类 HPSE 基因序列，使相关的研究进入了新的阶段。人类 HPSE 基因定位于染色体 4q21.3 位置，cDNA 全长 1 758 bp，编码的活性蛋白质分子量为 50 kD1，2。HPSE 在正常组织中的表达主要局限于胎盘和免疫器官，而在多种恶性肿瘤中有高水平表达 37。研究发现 HPSE 的表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移潜能密切相关。 肿瘤细胞的侵袭和转移， 必须突破细胞外基质和基底膜屏障。 细胞外基质是由多种大分子组成的复杂网络系统， 主要成分为型胶原、 层黏连

11、蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由一个蛋白质核心和多条 HS 侧链构成。基底膜是一种特殊的细胞外基质，呈坚固的薄纸样结构。 肿瘤细胞能够分泌多种降解酶， 破坏细胞外基质和基底膜屏障，常见的有基质金属蛋白酶、 丝氨酸蛋白酶等蛋白酶家族成员。 HPSE 是一种糖苷内切酶，可在数个位点上降解 HS，从而破坏细胞外基质和基底膜的完整性， 促进肿瘤细胞侵袭和转移。 目前的研究发现， HPSE 是唯一具有降解HS 活性的酶 1，这使 HPSE 成为研究抗肿瘤转移药物的新靶点。ASODN 通过碱基互补原理，与目的 mRNA 特定序列特异性结合，形成DNARNA杂合双链，诱导内源性RNA降

12、解酶H 对mRNA 链进行水解，并通过空间位阻效应阻断 mRNA 剪切加工、转运和蛋白质翻译合成，从而达到基因治疗的目的 8。Uno 等 9曾将 HPSE 反义核酸通过腺病毒载体导入人食管癌细胞系，明显降低了其 HPSE 表达水平和体外侵袭能力。我们针对 HPSE mRNA 的起始密码区设计合成了ASODN ，通过硫代磷酸化修饰增强其稳定性和抗酶解能力。寡核苷酸可通过被动扩散和细胞膜受体介导的胞吞作用进入细胞。阳离子脂质体在一定比例内能够中和寡核苷酸所带的负电荷，使寡核苷酸易于通过细胞膜，提高转染率。本实验通过半定量RTPCR、流式细胞学检测和Matrigel 细胞侵袭实验说明， HPSE A

13、SODN 能够在不同水平下调 HPSE mRNA 及其蛋白的表达，从而显著降低肺癌 A549 细胞的侵袭力，此抑制作用表现出明显的剂量依赖性。这表明，HPSE 参与肺癌细胞的侵袭和迁移，在肺癌细胞侵袭和转移中起重要作用，HPSE 可能会成为预防和治疗肺癌侵袭和转移的新靶点;通过 HPSE ASODN可能为肺癌的基因治疗提供一条新的途径，可望为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。【参考文献】1 Vlodavsky I ，Friedmann Y，Elkin M ，et al.Mammalianheparanase：gene cloning，expression and function in tu

14、mor progressionand metastasisJ. Nat Med,1999;5(7):793802.2 Hulett MD ，Freeman C，Hamdori BJ,et al.Cloning ofmammalian heparanase：an important enzyme in tumor invasion andmetastasisJ.Nat Med,1999;5(7)：8039.3 Shafat I，Pode D，Peretz T,et al.Clinical significance of urineheparanase in bladder cancer prog

15、ressionJ.Neoplasia，2008;10(2)：12530.4 Nobuhisa T，Naomoto Y，Ohkawa T,et al.Heparanase expression correlates with malignant potential in human colon cancerJ.J Cancer Res Clin Oncol，2005;131(4)：22937.5 Quiros RM ，Rao G，Plate J,et al.Elevated serum heparanase 1 levels in patients with pancreatic carcino

16、ma are associated with poorsurvivalJ. Cancer， 2006;106(3)：53240.6 田 辉，刘贤锡，王善政.MMP9、HPSE 和VEGFC蛋白表达在中老年人肺癌抗血管和抗淋巴管生成治疗中的意义J.中国老年学杂志， 2005;25(1):2931.7 Cohen E，Doweck I ，Naroditsky I,et al.Heparanase is overexpressed in lung cancer and correlates inversely with patient survivalJ.Cancer，2008;113(5)：1004 11.8 Crooke ST.Potential roles of antisense technology in