代谢组学概述(课件分享)

1、作者：作者：Dr.FengDr.Feng 代谢组学概述(课件分享) 代谢组学概述(课件分享) 目录 3 样品预处理与提取样品预处理与提取 4 代谢物检测技术代谢物检测技术 5 数据处理方法数据处理方法 6 研究计划研究计划 2 研究对象研究对象 1 背景、概念和意义背景、概念和意义 代谢组学概述(课件分享) 背景 概念 意义 代谢组学概述(课件分享) 对基因、mRNA、蛋白质的研究催生了基因组学、转录组学、蛋 白质组学。这些组学描述的内容是可能发生的事件，受到诸多环 境、饮食、年龄等因素的影响，且会有平衡和反馈机制，这些可 能的事件并不一定发生。 传统毒理学实验耗时、难以进行高通量研究，毒性终

2、点单一、难 以确定毒性作用机制，多研究致死效应，难以研究低浓度暴露的 影响与长期效应。 小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果； 其它组学所起的改变会在代谢层面放大，更灵敏； 代谢物结构与功能清楚，数量少，更容易解释其机理变化。 研究背景与意义优势优势 代谢组学概述(课件分享) 代谢组 代谢组学 环境 代谢组学 利用代谢组学技术探讨生物有机体与生态环 境之间相互作用的一门学科，着重于研究生 物体应对环境影响因素的代谢变化。 研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢 产物变化的科学，反映的是外界刺激或遗传 修饰的细胞或组织的代谢应答变化。 一个细胞、组织、器官或者一个生物体中在 某一特定状态

3、下的所有内源性小分子代谢产 物的集合，如氨基酸、糖、有机酸、脂肪酸、 核苷、核苷酸等。 研究背景与意义基本概念基本概念 代谢组学概述(课件分享) 代谢 产物 分析 代谢物靶 标分析 代谢轮廓 分析 代谢指纹 分析 代谢 组学 对少数所预设的一些代谢产物的定 量分析 对少数所预设的一些代谢产物的定量 分析 对限定条件下的特定生物样品中所有 代谢组分进行定性和定量 只有第只有第4层次才是真正意义上的代谢组学研究。目前，代谢组层次才是真正意义上的代谢组学研究。目前，代谢组 学的最终目标还是不可完成的任务。学的最终目标还是不可完成的任务。 研究背景与意义相关分类相关分类 定性并半定量分析生物样品中全部

4、代谢物 代谢组学概述(课件分享) 代谢组学应代谢组学应 用用 疾病诊断 药物研发 与评价 中药现代 化研究 营养代谢 组学 微生物和 植物研究 系统毒理 学 研究背景与意义应用应用 代谢组学概述(课件分享) 毒物与细胞或组 织相互作用 内源性代谢物质 比例、浓度变化 轻微时，与体液 交换组成进行代 谢调控 应用现代分析手 段定性和定量研 究内源性代谢产 物 分析生物体内在 毒物作用前后代 谢产物图谱的变 化 识别毒物靶标、 剂量关系、毒性 作用机制和生物 标志物 剧烈时，动态平 衡彻底丧失，体 液中出现毒性生 物标志物 研究背景与意义原理原理 代谢组学概述(课件分享) 研究流程研究流程 代谢组

5、学概述(课件分享) 研究流程 样品 制备 进行 动物 实验， 收集 生物 体液 和组 织样 本， 进行 样品 预处 理与 提取。 代谢物 检测 用高 通量， 高分 辨率， 高重 复性 的谱 学手 段， 如核 磁共 振 NMR、 液质 联用 LC/M S、 气质 联用 GC/ MS等 进行 检测。 数据 预处理 峰匹 配， 基线 矫正， 积分， 归一 化， 标度 化 多元数据 分析 结果 解释 模式识别和统计分析，如 PCA、PLS-DA、OPLS-DA等。 解析与机体生理病 理有关的生化过程。 代谢组学概述(课件分享) 实验对象 人类与鼠 类等陆生 脊椎动物 蚯蚓等陆 生无脊椎 动物 斑马鱼、

6、 虹鳟鱼等 鱼类 水稻、 拟南芥等 陆生植物 贻贝等软 体动物 浮萍等水 生植物 端足虫等 节肢动物 应用应用 较多较多 研究流程实验对象实验对象 代谢组学概述(课件分享) 样本来源样本来源 体液组织细胞其它 血、尿、唾液、 眼泪、精液、 羊水、脑脊液 以及各种腺体 的分泌液(胆 汁、胰液、肠 液) 心、肝、 脾、肺、 肾、肌 肉、骨 骼、脊 髓、脑 组织 动植物细 胞、酵母 细胞、细 菌、真菌、 病毒个体 血液被认为是最具研究价值的一种体液，含有多种代谢物，能够较 为全面反映生物体的代谢状况。尿液与肾有着密切联系，同时机体 代谢、疾病等情况，也会造成尿液中化学组成的改变。肝是进行代 谢的主要

7、场所。因此血、尿、肝组织的整合分析在代谢组学研究中 发挥着重要作用。 粪便等 研究流程样本来源样本来源 代谢组学概述(课件分享) 用水和有机溶 剂共同提取， 以分别获得亲 脂相和极性相 代谢物。推荐 甲醇/氯仿/水 （2/2/1.8）分 两次添加或乙 腈/甲醇/水 （2/2/1）一次 性添加。 提取 其它预处理 为避免由于残 留酶活性或氧 化还原过程降 解代谢产物和 产生新的代谢 产物，通常需 对所收集样品 进行快速淬灭， 灭活的方法很 多，如液氮冷 冻、酸处理等。 快速淬灭 研究流程样品预处理与提取样品预处理与提取 代谢组学概述(课件分享) 除了核磁共振NMR和普通的GC/MS、LC/MS之

8、外，用于代谢组学 的分析技术还有气相色谱-飞行时间质谱、超高效液相色谱-飞行时 间质谱、傅里叶变换质谱、傅立叶离子回旋共振-质谱和毛细管电 泳-质谱联用等。由于代谢产物和生物体系的复杂性，至今为止， 尚无一种能满足所有要求的代谢组学分析技术 。只有通过组合不 同的分析技术才能够比较全面准确地测定代谢组内容。 方法方法优点优点缺点缺点 NMR样品处理简单、无损伤性、测试手 段丰富、定性与定量分析、无偏向 性、分析快速 灵敏度低 GC/M S 高分辨率、高灵敏度、重复性好、 具备完整的数据库、分析成本较低 需衍生化、选择性分 析、定量不够准 LC/MS高灵敏度、动态范围宽、样品处理 简单、分析成本

9、较低 破坏性、选择性分析、 定量不够准、基质干 扰、无数据库 常用的代谢组学分析技术比较 研究流程检测技术检测技术 代谢组学概述(课件分享) 提高提高NMR灵灵 敏度敏度 分析注分析注 意事项意事项 GC/MS衍衍 生化生化 主要衍生化试剂是硅烷化试剂 MSTFA和BSTFA，三甲基氯硅烷可 用作衍生化催化剂，常溶于吡啶中 使用超高磁场强度的核磁共振波谱仪、 使用冷冻到4.5 K的探针、使用二维核 磁技术、用CPMG （CarrPurcellMeiboomGill）自旋回 波序列消除蛋白质类大分子物质的干 扰 研究流程检测技术检测技术 代谢组学概述(课件分享) 在生物样本中，并不是浓度高的代谢

10、物其对生物体系的影响 就一定大。因此在数据分析时对浓度大小不同的代谢物要一 视同仁。通常是采用单位方差缩放或Pareto缩放，即将每个 变量的数据点除以其标准偏差或标准偏差的平方根。 不同实验个体之间的差异可能较大，从而导致分析结果的偏差。 因此需要归一化来消除这种系统偏差。通常采用的方法是谱峰 总积分的归一化、肌酐浓度归一化和概率商归一化。 NMR数据包含了化学位移和 谱峰强度的信息。可采用仪器 自带的TOPSPIN软件进行手动 调相和基线校正，化学位移以 内标物定标。对一定区间的谱 图用极窄的分段进行分段积分 或完整输出，同时，去除包含 提取溶剂和内标峰的区间，然 后将积分表输出到文本文件

11、。 GC/MS和LC/MS数据包含了保 留时间、离子的质荷比m/z以 及谱峰强度的信息。可用 XCMS数据包对得到的总离子 流图谱进行峰匹配，峰识别及 峰对齐操作，并从中提取有效 数据。 导出导出 归一归一 化化 标度标度 化化 研究流程数据预处理数据预处理 代谢组学概述(课件分享) 模式识别方 法 非监督方法 主成分分析 系统聚类分析 非线性映射 监督方法 PLS-DA或 OPLS-DA 软独立建模分 类法 k-最近邻法 神经网络 PCA应用最广 泛，其将复杂 的数据降到一 个低维空间， 以分类图的形 式显示出来， 能够获得研究 对象的可视化 总览，而不受 其他人为因素 的影响。 为了在差异

12、较 为细小时获得 更为准确的结 果，偏最小二 乘法-判别分析 PLS-DA 根据样本间的 预设分类标准 来统计与建模。 OPLS-DA是先 采用滤噪技术 正交信号校正 来滤掉由与实 验目的不相关 的因素所引起 的代谢变化再 进行PLS-DA。 还需要验证模 型的有效性和 显著性。 研究流程多元数据分析多元数据分析 SIMCA-P (Umetrics AB, Ume, Sweden) 代谢组学概述(课件分享) 分析的结果以得分图表示样本的分离聚合情况，以载荷图表示样本之 间分类的差异变量。将载荷图与得分图对应起来看，就可以发现在与 样本分类聚集相应的方向上，那些离原点越远的变量（相应的权重系 数也越大），对分类的贡献越大。将这些变量所对应的谱峰与代谢物 数据库进行比较确定它是什么代谢物，进而推断机制，并有可能找到 生物标志物。 研究流程多元数据分析多元数据分析 代谢组学概述(课件分享) 数据库名数据库名网址网址说明说明 KEGG关于代谢调节和通路的数据库 HMDB人体低分子质量代谢物数据库 MetaCyc关于代谢物的数据库，包括超 过 150种生物体中的各种代谢 途径 LipidSearc h 脂类代谢物数据库 Metcore人类信号表达、调控以及代谢 物的生物通路数