医学免疫学实验：小鼠脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色

1、小鼠脾脏单个核细胞分离及小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色流式细胞术染色 实验四实验四 小鼠脾脏脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形体积较大，长条形，属于外外 周免疫器官周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循 环驻入脾脏等外周免疫器官 的特定区域，所以富含各类 免疫细胞。 解剖图解剖图 脾脏功能脾脏功能 占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨嗜淋巴细胞和巨嗜 细胞细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心机体细胞免疫和体液免疫的中心 通过多种机制发挥抗肿瘤作用. 脾脏切除导致细胞免疫和体液 免疫功能的紊乱，影响肿瘤的发生和发展 人和脊椎动物最大的淋巴器官最大的淋巴器官。人的脾脏

2、位于左季肋区的 后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器滤过器，能清除血 液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小 板。 为实质性器官，质软而脆，若受暴力作用，易破裂出血而成为 急腹症急腹症。 实验原理实验原理 细胞浓度细胞浓度 =(W1+W2+W3+W4)/4 =(W1+W2+W3+W4)/410104 4/ml/ml稀释倍数 细胞计数细胞计数 W1 W2 W3 W4 3mm 计数原则：计数原则： 边界线：上计下不计；左计右不计 血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗 后自行晾干或用吹风机吹干 台盼蓝原理台盼蓝原理: 正常正常的活细胞，胞膜结构完整胞膜结构完整，

3、能够排斥排斥台盼蓝，使之不 能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透 性增加，可被台盼蓝染成蓝色蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失细胞膜完整性丧失， 即可认为细胞已经死亡死亡。 lived dead 实验材料：实验材料： 小鼠小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒平皿，尼龙膜指套、研磨棒 PBSPBS缓冲液、红细胞裂解液（缓冲液、红细胞裂解液（ACKACK） 细胞计数板细胞计数板 0.2%0.2%台盼蓝染液台盼蓝染液 显微镜显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！）（关掉之前，请把光度调到最小！） （一）取小鼠脾脏： F小鼠颈椎脱

4、位处死（注意安全注意安全）； F用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织； 实验步骤实验步骤 （二）制备单个核细胞悬液： F将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼 龙指套悬浮于平皿中；再取3mlPBS冲洗培养皿后移入 15ml离心管。 F1500rpm离心5min(注意配平注意配平）。弃去上清，加ACK至 2ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。然后 加PBS缓冲液1ml，以1500rpm离心5min； F弃去上清，加PBS缓冲液1ml到离心管中，吹打混匀即为

5、小鼠脾脏单个核细胞悬液。 （三）计算细胞浓度 F将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾小鼠脾 脏细胞一般为脏细胞一般为1x101x107 7-2x10-2x108 8）； F混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； F计算细胞总数： 细胞浓度细胞浓度=4=4个大方格细胞总数个大方格细胞总数/4/4* *10104 4* *稀释倍数。稀释倍数。 细胞总数细胞总数=细胞浓度细胞浓度x x细胞悬液的体积细胞悬液的体积 （四）计算细胞活力 F10l细胞悬液+ 10l的0.2%苔盼兰溶液并混匀； F显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色

6、，旋转显微镜微调 节钮，细胞无反光，则为死亡；而细胞不被染色，晶莹 透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞； F计算细胞活力：计数活细胞的百分率，一般活力应在 95%以上。 注意：注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100% 1.颈椎脱臼处死小鼠颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏研磨脾脏：在

7、培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。 4.离心离心：1500rpm，4，5min，去上清，弹散细胞沉淀 5.裂解红细胞裂解红细胞：加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀细胞，裂解2min后， 加入1ml PBS终止 6.离心离心：1500rpm，4，5min，去上清，弹散细胞沉淀，加入1mlPBS， 吹打混匀,过指套，细胞进行计数。 7.计数计数：可用1.5mlEP管将细胞稀释10倍后，再利用血球计数板进行计数， 10l细胞悬液+ 10l

8、的0.2%苔盼兰溶液混匀区分死（活）细胞 注意：步骤2以后，尽量在冰上或其他低温环境下进行操作 （五）流式细胞术染色 1.收集细胞：取细胞总数约1x106-5x106脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在 管盖上标记好组别），1500rpm， 4，5min（离心机需预冷） 2.染色：小心用枪吸去上清，再加入50ul预混抗体的PBS（ CD3抗体 100倍稀释； CD4抗体200倍稀释； CD8抗体500倍稀释），将细胞吹 打混匀，避光，415-20min 3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4，5min 4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于

9、冰上， 流式细胞仪检测 CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell F通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。 F在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。 F计数完毕后请立即清洗细胞计数板！计数完毕后请立即清洗细胞计数板！ F所有器械洗净摆好，老鼠尸体统一放入垃圾袋送至所有器械洗净摆好，老鼠尸体统一放入垃圾袋送至516516 补充知识补充知识 思考题思考题 1.实验过程中注意问题有哪些？ 1颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向

10、后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。 2空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。 3急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 4吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在2030秒 陷人麻醉状态，35min死亡。 5注射麻醉法：应用戊巴比妥钠注射麻醉致死。 6 吸入二氧化碳：此法安全、人道、迅速，被认为是处

11、理啮齿类的理想方 法，国外现多采用此法。可将多只动物同时置入一个大箱或塑料袋内，然后 充入CO2，动物在充满CO2的容器内l3min内死去。 实验小鼠处死方法 1颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。 2空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。 3急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 4