蛋白质印迹法westernblot应用介绍.

1、蛋白质印迹法（western blot技术）威斯腾生物技术中心2014. 9. 1全国免电话:400-675-675WWW.Western Biotechnology Inc-Western Blot介绍Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析Western Biotechnology Inc全国免更电话400-675-6758Western Blot 介绍Western Biotechnology Inc.全国免更电话 400-675-6758 网址:蛋白质印迹的发明者一般认为是戻国随坦扌葩丸学的乔治斯塔 克(George Stark ) 在尼尔伯奈特(Neal

2、Burnette)于 1981 年所 著的刁“亡也生今(Analytical Biochemistry )中首次被称为 Western Blot.蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或纽织 总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特 异性抗休检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用 于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等 多个方面。Western Biotechnology Inc.全国免毋电话 400-675-6758 网址:电泳昨瑤ft闭和;洗入二统T匕隼蛋分多次将细 胞收至一个（Protein sample prepar

3、ation）（1）贴壁细胞蛋白样品收集 A收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心 收集细胞。C将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离 心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂 解液200 口 1于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶 使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30minoD裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至15ml EP管中，再用超声破%举仪破碎细胞后，4C下12000rpm离 心15min,吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。Western Biotechnology Inc.

4、全匡免西电话 400-675-6758 R目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考 马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、BCA法等。1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300 gg/mL （用 PBS配制）样品液：取原液2 口 L至200 pL （用PBS配制）。2、操作：先取一块新的96孔板，于下测光密度值，取溶液/样品40pL和E液40 pL,每个浓度点均作三复孔，振 荡混匀。37 C反应10 min后，加入福林酚试剂（1: 15稀释） 160 pL,振荡混匀，37 C反应30 mino 630 nm下测光密度值 以标准蛋白浓度对光密度

5、值作出标准曲线，计算待测样品 蛋白浓度。全国免芟电话400 675 6758Western Biotechnology IncWestern Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-675jwww.cqwesiern.u分嵩欣浓Jl与妥匂分禽范Bl栽胶浓度(%)最住分需范谢CKD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下层胶（分离胶）5ml10 mliSmi20wi*L?US.06.62.9ao00.0ISM Trb(pHS 8|13IS111.010HSOS060.1e.i$210HAM03aie.H0.2flMD0.0020 0

6、04o.ooto.oos赫置lh后制上层胶（浓缩胶）2.配制上层胶（浓缩胶）,5“SmiI10 ml4.1m fMxarflui*O.t)1.0l.OM TrbfpHI040.7S10讣03O.g08OMO.M0 滤纸、胶、膜之间不能有气泡. 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序. 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。Western Biotechnology Inc全国免费电话400-675-67589转膜后检测（此步可以省略）/丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝 酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射

7、性标记A蛋 白探针Western印迹过程。将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是便抗体与特异的 蛋白质结合.封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml ） 牛血清白蛋白溶液（BSA ） 摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或49过夜. 抗体浪度过.需 封闭不丸分 朕没有均匀澡迄 朕丸者圾冲液污黑 统体与封闭射出现 夾又反应杂夾甫检测一执二执的工作滾度延长対現对间或更换封用棉朕奇用甲醇将膜丸全沒套取膜与浹水烦对要栽手 廉，更换祈埒此膜圾冲潅检测一执.二抗与耐囲#1是否力吏又反应Western Biotechnology Inc.全匡免芟电话 400-675-6758

8、 冋址:非特异条帑多 抗体浓度过嵩鎂没有均匀澡遅 膜或舟圾冲波活柴 封闭不克分抗体与封用*1出现/ 杂交前检测一抗.二抗 的工作滾夂丁林膜前用100%甲瑋将膜 克全澡迄V 拿取鎂与戒水纨对要裁 手去，更换新鲜转朕皱 冲液 检測一抗.二抗与封囲 制是否有交反应妥勺帶型条状Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758上样过査 样嬴沉|建 样嬴中的污染 制肤不佳V阵低上样*丁加大样品中的SD5浓夂丁 直心样 确毎灌肤均匀Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-丁完全变性蛋白/ 确保加入足够的DTT或卩-疏基乙醇/观察指示剂染料，掌握恰当的电泳时间型条带或微笑”条带Western BiotechnologY Inc全国免更电话 006756758网址www.cqweslern.co01上样体积过大导致不完 全堆积 电泳过程中电场不均匀分离胶表面不齐/使用恰当