蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题解析

1、本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a (+),从EcoRI和Hi nd川酶切位点插入PCF产物-PrP 435。但由于单菌落所得载体pET-32a (+)在EcoRI位点突变，由GAATT突变为GAATT(已测序)，按第一章方法 构建重组表达质粒PrP-pET-32a (+),在4C连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a 未获成功。而将一周以后在4C保存的连接液TSS法转化E.coli DH5a却获成功。 我们利用双引物primer genome进行菌落PCF筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的DNA片断，实验结果却扩增出约 1300 bp，860 bp

2、，430 bp三个DNA条带。 消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA条带。由此我们怀疑可能是PCFT物 串联以后连入 pET-32a( +)。根据 以 上现 象我 们 对 结 果 作如 下探 索： 疑 似 串联 重 组质 粒命 名为 PrPx-pET-32a (+)，PrPx-pET-32a (+)转化 E.coli BL21 (DE3，进行表达鉴 定；EcoRI单酶切PrPx-pET-32a (+)，琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得 单拷贝阳性克隆；用引物 primer vector进行菌落PCR鉴定；使用5 primer genom单 引物进行菌落PCF筛选鉴定；PrP x-pET-

3、32a (+)和pET-32a (+)测序。试验结 果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白(35 KD)多15 KD,相当 于 2 倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。 由于插入片段已突变出两个终止子， 所以我 们认为PrP435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向 插入。使用5 primer genome单引物进行菌落PCR试验结果扩增出约860 bp,420 bp， 两个DNA片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。因为，由图3-5，使用5 primer genome单引物进行菌落PCF时，上游因物在 E1-E6 处和 PrPx-pE

4、T-32a ( +)退火，下游引物在 H1-H5处和 PrPx-pET-32a (+) 退火，上游因物带有EcoRI酶切位点可以与载体上 E0产生错配。所以E1和H1 之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4 之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq酶同时往中间扩增，Taq酶要占 一定的空间，就会使下游引物所加的Hind川酶切位点和三个保护性碱基消失一 部分，扩增出约420 bp (比430 bp 小)条带。其他各条带可同理推出。EO H 1 E2 H 3 E4 115 E6El H2 E3 H4 E5PrPx-pET-32a (+) MC

5、S图3-5串联质粒PrPx-pET-32a (+ )多克隆位点Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrP x-pET-32a (+)sense strand ,anti- sense strand, H Hind 川，E EcoRI,vector本实验早期我们用EcoRI单酶切PrPX-pET-32a (+),琼脂糖凝胶回收，并 重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。原 因是EcoRI位点突变(已测序)。以后重复该实验所用pET-32a (+) EcoRI位点完好，EcoRI单酶切PrPx-pET-32a (+),琼脂糖凝

6、胶回收，重新连接，实验 结果获得单拷贝阳性克隆。PrPx-pET-32a (+)经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成 功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA的某种二级结构造成测序困难。虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot鉴定(使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强， 未能得到好的照片)；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生 一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物Primer genome两个酶切位点

7、作颠倒，使用单酶切两种 PCF产物(酶切位点相互颠倒)，作连接 以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个 连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP核心片段的反义肽，可做反义肽方面的 进一步探索。有时候实验中出现串连并不是我们所期望的， 如何避免串连，提高连接效率 ? 笔者做过这方面的探讨。 具体如下： 由于细菌在遗传上的不稳定性， 在进行细菌 操作时，应挑选多个菌落。在实验过程中曾经遇到pET-32a (+) EcoRI位点由GAATT(突变为GAATT(已测序)，造成连接以后连接产物的串联，就是由于在 操作过程中挑选单个菌落造成的。重组质粒构建通常使用酶切然后胶回

8、收再连接、 转化，最后进行阳性克隆鉴 定的方法。 但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、 转化效率低、 串连等 问题。特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用 buffer 中的效率不一致，琼脂 糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切， 连接产物中可能混有大量的空载体， 这样 就会给阳性克隆筛选带来麻烦。 还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别 核苷酸的丢失， 还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。 我们将重组质粒的 构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。具体操作介绍如下：pET-32a( +)去RNA经溶液U、溶液川、氯仿、乙醇沉淀。将 pET-32a (+) 与PCR产物按1: 20

9、的比例混合，EcoRI和Hi nd川双酶切2小时。酶切产物不 进行任何形式的纯化，直接用 1/10 量连接 2 小时。连接产物立即转化 E.coli DH5x，在含50 ug/ml AMP的液体TB培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。 用pET-32a( +)多克隆位点上EcoRI和Hi nd川之间已被双酶切去除的 Sal I位 点对应酶Sal I单酶切(图1 8)，使pET-32a (+)空载体线性化。酶切产物 转化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑单菌落进行菌落 PCR筛 选阳性克隆。 转化 E.coli BL-21 之前也可进行阳性克隆富集。 上述包

10、含阳性克 隆和pET-32a (+)空载体混合质粒，用 Sal I和Xhol I双酶切，乙醇回收去掉 小片段，T4DNA连接酶连接反应体系同上。TSS缓冲液转化E.coli BL-21 (DE3。(图 1-7， 1-8 )pET-32a+) + PCR 产物 1： 20EcdR I. Hind HI双酶切1/10量双热切产物连接I转化层co2jDH5 ot 50ug/ml anip液体LB培养基中过夜I收集细菌提取质粒Sal /单酶切使pET-32a ( + )空载体线性化(或Sal I和Xhol I双酶切，乙醇回收去掉小片段,去掉空载体，T4 DNA连接酶连接，富集阳性克隆)转化 E col

11、l BL-21 涂布含 SOug/ml amp LB 平板II菌落PCR筛选阳性克隆图1-7 一种新的重组质粒构建方法Fig.1-7 A new method for the con truct ion of recomb inant plasmidH/nd III 翻Ava IXho IpET-32a(+) MCSNeo I EcoR V BamH I EcoR I Sac I Sa/1CCCATCCCTOATATCGCATCCCAATTCCACCTCCGTCCACAACCTTCCCOCCCCACTCCAG AIoMetAIoA$dIIeGIySerGIuPheGIuLeuArgArgG nA IaCy$GI/ArgThrArgA图1-8 pET-32a (+)多克隆位点Fig. pET-32a(+ ) MCS此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，Sal I单酶切使pET-32a(+)空载体线性化。E.coli BL-21的转化效率大约是E.coli DH5x的1/10 (见pET System Manua22页)，线性化pET-32a (+)比超螺旋质粒转化率 低的多，线性化空载体转入 E.coli BL-21的几率很小。经两次富集阳性克隆， 菌落PCR筛选阳性克隆率几乎100%传统方法使用胶回收pET-32a (+)的浓度很低，难于测定0D6。值，载