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文档简介
1、分子生物学实验室分子生物学实验室 张华屏张华屏 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 凝胶的制备凝胶的制备 以琼脂糖为溶质,以琼脂糖为溶质,电泳缓冲液电泳缓冲液为溶剂,用为溶剂,用 微波炉加热,配制微波炉加热,配制一定浓度一定浓度的溶胶,灌入水的溶胶,灌入水 平胶框,插入平胶框,插入梳子梳子,自然冷却。,自然冷却。 样品配制与加样样品配制与加样 dna样品用适量样品用适量tris-edta缓冲液溶解,缓冲液内含有缓冲液溶解,缓冲液内含有 0.25%溴酚蓝或其他指示染料,溴酚蓝或其他指示染料, 含有含有10%-15%蔗糖或蔗糖或5% 10%甘油,以增加其比重,甘油,以增加其比重, 使样品集中。使样品集中
2、。 电泳电泳 低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,低电压下,分离效果较好。在低电压条件下, 线性线性dna分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。 因此,为了获得电泳分离因此,为了获得电泳分离dna片段的最大分辨片段的最大分辨 率,所用电压不宜高于率,所用电压不宜高于5v/cm。cm:电场正负极:电场正负极 间的距离。间的距离。 染色和拍照染色和拍照 常用荧光染料溴化乙锭(常用荧光染料溴化乙锭(eb)染色,在紫外光)染色,在紫外光 下观察下观察dna条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶 成像系统输出照片,并进行有关的数据分析。成像
3、系统输出照片,并进行有关的数据分析。 l核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单 链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链 的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸, 杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。 l核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱 基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区, 这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并 不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不 同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的 互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在 dna与dna、rna与rna或rna与dna的二条单链之 间。 l核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中 应用最广泛的技术之一,是定
4、性或定量检测特异 dna或rna序列片段的有力工具 l在基因工程技术中,用放射性标记或非放射性 标记的探针进行菌落杂交,可以从cdna文库 或基因组文库中筛选出特定的克隆,获得某一 重组体;用克隆化的dna片段做探针杂交,可 以确定基因组dna上特定区域的核苷酸同源序 列或对某一已知基因进行染色体定位另外, 用于遗传疾病的基因诊断,限制性片段长度多 态性疾病的相关分析,基因连锁分析,法医学 上的性别分析和亲子鉴定等 l分子印迹(渍)分子印迹(渍) 技术技术 l固相支持物(硝固相支持物(硝 酸纤维素虑膜和酸纤维素虑膜和 尼龙膜)的特点尼龙膜)的特点 l分子印迹(渍)分子印迹(渍) 的分类的分类
5、l分子杂交技术分子杂交技术 l核酸分子杂交 的原理 探针的分类探针的分类 杂交技术杂交技术 l分子印迹(渍)的分类分子印迹(渍)的分类 ldna的变性和复性 分子印迹(渍)技术分子印迹(渍)技术 将待测生物大分子结合到一定的将待测生物大分子结合到一定的固相固相 支持物支持物上的方法。上的方法。(这些结合在固相支持这些结合在固相支持 物上的生物分子即可与存在于液相中的探物上的生物分子即可与存在于液相中的探 针分子进行杂交。针分子进行杂交。) 固相支持物固相支持物与与有效的转移方法有效的转移方法是此技术的是此技术的 成败关键。成败关键。 固相支持物应具备的特点:固相支持物应具备的特点: 1.具有较
6、强的结合核酸分子的能力(具有较强的结合核酸分子的能力(10g/ /cmcm2 2) 2.与核酸结合后,不影响其与探针分子的杂交反应。与核酸结合后,不影响其与探针分子的杂交反应。 3.与核酸稳定牢固结合,能经受杂交、洗膜等操作。与核酸稳定牢固结合,能经受杂交、洗膜等操作。 4.非特异性吸附少,洗膜条件下能将非特异性吸附非特异性吸附少,洗膜条件下能将非特异性吸附 在其表面的探针分子洗脱掉。在其表面的探针分子洗脱掉。 5.具有良好的机械性能,如柔软性,柔韧性。具有良好的机械性能,如柔软性,柔韧性。 几种常用固相支持物几种常用固相支持物 硝酸纤维素滤膜(硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose f
7、ilter membrane) 具有较强吸附单链具有较强吸附单链dna和和rna的能力(高盐的能力(高盐 下达下达80g/ /cmcm2 2100g/ /cmcm2 2)。)。 真空烘干后,依靠疏水性相互作用。真空烘干后,依靠疏水性相互作用。 杂交本底较低杂交本底较低 不易反复杂交和洗膜(结合力)不易反复杂交和洗膜(结合力) 质地较脆,烘烤后更甚,需小心操作质地较脆,烘烤后更甚,需小心操作 与核酸结合依赖高盐,低盐结合不佳,不易核酸电转与核酸结合依赖高盐,低盐结合不佳,不易核酸电转 尼龙膜(尼龙膜(nylonmembrane) 结合单链结合单链dna和和rna的能力比的能力比nc膜强(达膜强(
8、达350g/cm/cm2 2500 g/ /cmcm2 2)。)。 真空烘干后或紫外线照射可强化结合(短波真空烘干后或紫外线照射可强化结合(短波uv照射后照射后,部分嘧啶部分嘧啶 碱基与其氨基交联,更加牢固)。碱基与其氨基交联,更加牢固)。 微波处理和碱处理也可促结合,从而使细菌裂解、微波处理和碱处理也可促结合,从而使细菌裂解、dna变性与固变性与固 定一步完成(菌落原位杂交)。定一步完成(菌落原位杂交)。 韧性较强,操作方便。韧性较强,操作方便。 能结合小分子核酸。能结合小分子核酸。 低盐也能很好结合(可用于核酸电转移)。低盐也能很好结合(可用于核酸电转移)。 可反复杂交和洗膜。可反复杂交和
9、洗膜。 杂交本底较高杂交本底较高 是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在 纤维膜上的过程。纤维膜上的过程。( (将核酸或蛋白质从电泳后的将核酸或蛋白质从电泳后的 凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上) ) 转膜转膜 转膜的方法转膜的方法 (1 1)物理吸印方法)物理吸印方法(毛细虹吸或真空抽吸)(毛细虹吸或真空抽吸) (2 2)电转印方法)电转印方法 southern blot northern blot western blot eastern blot dot blot in situ hybridization lso
10、uthern blot dna(由edwin mellor southern 等人首次应用) 1975年,年,southren创造了将创造了将dna区带原位转移区带原位转移 到硝酸基纤维素膜(到硝酸基纤维素膜(nc膜)上,再进行杂交的膜)上,再进行杂交的 方法,被称为方法,被称为southren印迹法。印迹法。 lnorthern blotrna alwine等将类似方法用于等将类似方法用于rna印迹,被称为印迹,被称为 northern印迹。印迹。 western blotprotein(immunoblotting) 1979年年towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝等设计了将蛋白质从
11、凝胶转移到硝 酸纤维素膜的装置,将蛋白质转移到膜上,再与酸纤维素膜的装置,将蛋白质转移到膜上,再与 相应的抗体等配体反应,被称为相应的抗体等配体反应,被称为western印迹,印迹, eastern blot 1982年年reinhart等用电转移法将等电聚焦等用电转移法将等电聚焦后的蛋后的蛋 白质区带从凝胶转移到特定膜上,称白质区带从凝胶转移到特定膜上,称eastern印迹。印迹。 ldna变性 方法 l热变性:90100 l酸碱变性:常采用碱变性 l化学试剂变性:尿素、甲酰胺、甲 醛等 特点:粘度增加、密度增加、增色效 应、溶解温度(melting temperature,tm) ldna
12、复性或杂交(hybridization) dna/dna,dna/rna,rna/rna等 核酸分子杂交的基础 增色效应增色效应(hyperchromic(hyperchromic effect) effect): 指指dnadna变性后其紫外吸收明显增强的变性后其紫外吸收明显增强的 效应。效应。 dnadna分子中碱基间电子的相互作用使分子中碱基间电子的相互作用使dnadna 分子具有吸收分子具有吸收260nm260nm波长紫外光的特性。波长紫外光的特性。 在在dnadna双螺旋结构中碱基藏入内侧,变性双螺旋结构中碱基藏入内侧,变性 时时dnadna双螺旋解开,于是碱基外露,碱基双螺旋解开,
13、于是碱基外露,碱基 中电子的相互作用更有利于紫外吸收,中电子的相互作用更有利于紫外吸收, 故而产生增色效应。故而产生增色效应。 l双链双链dna进行加进行加 热变性,当温度升热变性,当温度升 高到一定高度时,高到一定高度时, dna溶液在溶液在260nm 处的吸光度突然明处的吸光度突然明 显上升至最高值,显上升至最高值, 随后即使温度继续随后即使温度继续 升高,吸光度也不升高,吸光度也不 再明显变化。若以再明显变化。若以 温度对温度对dna溶液溶液 的紫外吸光率作图,的紫外吸光率作图, 得到的典型得到的典型dna 变性曲线(变性曲线(s型)。型)。 dnadna变性是在一个很窄的温度范围内发生
14、的。变性是在一个很窄的温度范围内发生的。 通常将核酸加热变性过程中,紫外光吸收值通常将核酸加热变性过程中,紫外光吸收值 达到最大值的达到最大值的50%50%时的温度称为核酸的解链时的温度称为核酸的解链 温度,由于这一现象和结晶的融解相类似,温度,由于这一现象和结晶的融解相类似, 又称融解温度又称融解温度(tm,melting temperature)(tm,melting temperature)。 在在tmtm时,核酸分子内时,核酸分子内50%50%的双螺旋结构被破的双螺旋结构被破 坏。特定核酸分子的坏。特定核酸分子的tmtm值与其值与其g gc c所占总碱所占总碱 基数的百分比成正相关,两
15、者的关系可表示基数的百分比成正相关,两者的关系可表示 为:为: tm = 69.3tm = 69.30.41(g+c)%0.41(g+c)% dna的复性的复性(renaturation) 变性的变性的dna在适当条件下,两条互补链全在适当条件下,两条互补链全 部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。 热变性的热变性的dna经缓慢冷却后即可复性,经缓慢冷却后即可复性, 这一过程也称为退火这一过程也称为退火(annealing)。 dna的复性的影响因素的复性的影响因素: l1、温度和时间:、温度和时间: l一般认为比一般认为比tm低低5左右的温度是复性的最佳左右
16、的温度是复性的最佳 条件,越远离此温度,复性速度就越慢。复性条件,越远离此温度,复性速度就越慢。复性 时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过tm 的温度下迅速冷却至低温的温度下迅速冷却至低温(如如4以下以下),复性几,复性几 乎是不可能的,核酸实验中经常以此方式保持乎是不可能的,核酸实验中经常以此方式保持 dna的变性的变性(单链单链)状态。状态。 l这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。 l2、dna浓度浓度:溶液中:溶液中dna分子越多,分子越多, 相互碰撞结合的机会越大,有利于复性。相互碰撞结合的机会越大,有
17、利于复性。 l3、dna顺序的复杂性顺序的复杂性: l简单顺序的简单顺序的dna分子,如多聚分子,如多聚(a)和多聚和多聚 (u)这二种单链序列复性时,互补碱基的这二种单链序列复性时,互补碱基的 配对较易实现。而顺序复杂的序列要实配对较易实现。而顺序复杂的序列要实 现互补,则困难得多。现互补,则困难得多。 ldna探针探针 lcdna探针探针 lrna探针探针 l寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针的分类探针的分类 根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为 l高度灵敏性 l标记物与探针的结合不影响碱基配 对的特异性 l不影响探针分子的主要理化特性 (tm值等) l
18、用酶促方法进行标记时酶的活性应 不受影响 l检测应具有特异性 l放射性标记放射性标记 l缺口平移法缺口平移法(nick translation) l随机引物法 ldna快速末端标记 l聚合酶链式反应法 l化学标记技术:直接与核酸进行化 学反应而连接在核酸上 缺口平移缺口平移 该技术由该技术由kelly等于等于1970年创立。其原理是首先年创立。其原理是首先 用用dna酶在双链酶在双链dna探针分子的一条链上制造一些探针分子的一条链上制造一些 缺口(缺口(nick),缺口处会形成缺口处会形成3羟基末端,这时再在羟基末端,这时再在 大肠杆菌大肠杆菌dna聚合酶聚合酶i的催化下将核苷酸残基加在的催化
19、下将核苷酸残基加在3 羟基上,同时,根据大肠杆菌酶羟基上,同时,根据大肠杆菌酶dna聚合酶聚合酶i的的 53核酸外切酶活性,此酶将缺口核酸外切酶活性,此酶将缺口5侧核苷酸依次侧核苷酸依次 切除,形成缺口平移。根据这个原理,如果用高强度切除,形成缺口平移。根据这个原理,如果用高强度 的放射性核苷酸(通常为的放射性核苷酸(通常为-32pdatp)置换先前存在)置换先前存在 的核苷酸,得到的核苷酸,得到dna探针。探针。 用缺口平移法标记的用缺口平移法标记的dna探针能满足大多数杂探针能满足大多数杂 交要求。交要求。 随机引物延伸随机引物延伸 以单链以单链dnadna或或rnarna模板合成高比活性
20、模板合成高比活性32p32p标记探针标记探针 的方法。将长的方法。将长6 68nt8nt的寡核苷酸片段与变性的的寡核苷酸片段与变性的dnadna或或 rnarna模板退火,在模板退火,在klenowklenow片段的作用下,以每一个退片段的作用下,以每一个退 火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发dnadna链的合成,链的合成, 在反应时将在反应时将-32pdntp-32pdntp掺入合成链,即得到标记。掺入合成链,即得到标记。 变性处理后,新合成链(探针片段)与模板解离,即变性处理后,新合成链(探针片段)与模板解离,即 得到无数各种大小的探针得到无数各种大小的探
21、针dnadna。 因为所用寡核苷酸片段很短,在低温条件下可与因为所用寡核苷酸片段很短,在低温条件下可与 模板模板dnadna随机发生退火反应,因此被称为随机引物随机发生退火反应,因此被称为随机引物 (random primerrandom primer)。)。 l放射性同位素放射性同位素 灵敏度极高,可以检测灵敏度极高,可以检测10-1410-18g的物质。最适条件的物质。最适条件 下,可以测出样品中少于下,可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。个分子的核酸含量。 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质,放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质, 对酶促反应无任何影响,不会影响碱基配对的特异对酶促反应无任何影响,不会影响碱基配对的特异 性、稳定性和杂交性质。性、稳定性和杂交性质。 特异性高,假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。特异性高,假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 缺点缺点: 放射性污染。放射性污染。 过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。过强的放射线可
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