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文档简介
1、目录抗菌多肽药物的制备方法 2第一章 文献综述 41.1 抗菌肽的分类 41.2 抗菌肽的性质 51.2.1 抗菌肽的一般理化性质 51.2.2 抗菌肽的生物学特性 51.3 抗菌肽的作用机理 51.4 抗菌肽的制备方法 61.4.1 生物材料提取法 61.4.2 化学合成法 61.4.3 基因工程法 61.4.4 酶解法 71.5 抗菌肽在各方面的应用前景及目前存在的问题 71.5.1 抗菌肽在医疗方面的应用 71.5.2 抗菌肽在食品方面的应用 81.5.3 抗菌肽在禽畜养殖业方面的应用 81.5.5 抗菌肽研究存在的问题 81.6 基因工程制备抗菌肽简介 91.6.1 抗菌肽分子设计及改
2、造策略 91.6.2 目的基因的获取 121.6.3 制备重组抗菌肽 12第二章 抗菌多肽的制备工艺 142.1 目前抗菌多肽的生产方法 142.2 抗菌肽制备改造设计 162.2.1 抗菌肽改造的原因 162.2.2 抗菌肽改造的方法 172.2.3 抗菌肽改造的依据 17图 2 抗菌肽的筛选 182.3 抗菌肽的筛选 192.3.1 通过生物信息学工具优化抗菌肽结构参数 192.3.2 抗菌肽的合成、纯化 192.3.3 抗菌肽的活性检测 202.3.4 抗菌肽的结构检测 202.4 宿主菌的育种车间工艺流程及主要设备 222.4.1 主要设备以及用途: 222.4.2 制备基因 222.
3、4.3 构建重组表达载体 232.4.4 目的基因片段与载体的连接 232.4.5 宿主菌的制备 232.4.6 连接产物转入大肠杆菌 242. 4.7 筛选 242.5 抗菌肽的表达、纯化及分离的工艺流程及主要设备 242.5.1 主要设备及其用途: 242.5.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达 242.5.3 融合蛋白的表达及制备 252.5.4 抗菌肽的切割和纯化 252.6 抗菌肽抗菌活性的检测 25第三章 抗菌肽药物的前景展望 26抗菌多肽药物的制备方法摘要抗菌多肽是抗生素的一种。 近年来,抗生素的滥用导致抗生素的耐药性是一 个急需解决的问题, 而抗菌多肽药物具有抗菌谱广, 作用强且迅
4、速, 不易产生耐 药等优点; 这些优点,使得抗菌肽类药物有巨大的被开发价值, 并具有成为最有 可能取代其他抗生素的新型抗菌药物的潜能。 虽然抗菌肽的来源非常广泛, 可以 来源于动物,植物,微生物等;但是抗菌肽的工艺化生产还有许多问题需要解决。 在天然抗菌肽很少, 人工合成抗菌肽成本太高的形势下, 寻找一个能大量合成抗 菌肽,并且成本相对比较低的抗菌肽的制备方法是本文的目的。 本文通过查阅大 量的相关文献, 综合实际情况, 选择使用 DNA合成仪合成抗菌肽基因, 以大肠杆 菌作为表达系统并通过融合表达的方式来生产抗菌肽。 根据大肠杆菌密码子偏爱 性和稀有密码子改造抗菌肽基因, 首先以数据库作为理
5、论基础,以计算机软件 作为理论辅助, 理论上筛选出抗菌活性的抗菌肽, 再通过实验来进一步筛选, 最 终选出最优异的抗菌基因, 然后通过基因工程制备出抗菌肽; 最后通过 TTC微量 稀释法检测抗菌肽抑菌活性。关键词: 抗菌多肽;生产工艺;基因工程;抑菌活性;AbstractAntimicrobial peptides are members of the antibiotic family. Inrecent years, an urgent problem is that the overuse of antibiotics leads to antibiotic resistance. An
6、timicrobial peptides have many important advantages such as broad spectrum antimicrobial, strong and fast effect, and uneasy to produce drug resistance. These advantages make antimicrobial peptides possess tremendous value on the field of new drugs development and thus the potential to become a perf
7、ect alternative of antibiotics. Although antimicrobial peptides can be obtained from wide range of sources, for instance animals, plants and microorganisms, there are manyp roblems need to be solved before its factory production. Nowadays, seldom natural antimicrobial peptides are available and the
8、synthesis of these peptides is expensive. Therefore, the aim of this study is to develop an effective strategy for producing antimicrobial peptides at relatively low cost. We firstly synthesize antimicrobial peptide genes with DNA synthesizer, the Escherichia coli was selected as expression system t
9、o produce antimicrobial peptides from the synthesized genes. Primers were designed according to the E. coli codon preference and amino acid sequence of antimicrobial peptides. Recombinant expression vectors were constructed and induce expressed in E. coli. Gene products were purified by hydroxylamin
10、e cut buffer to release antimicrobial peptides. Activity of antimicrobial peptides was detected by TTC microdilution.Keywords : antimicrobial peptides; production process; genetic engineering; antibacterial activity;第一章文献综述抗菌多肽 (antimicrobial petides,AMPs) 是在生物体中具有抗菌活性的肽 类物质的总称, 是宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的
11、小分子蛋白, 是生 物体先天免疫系统的重要组成部分,对真菌,细菌,病毒,线虫等具有广泛的杀 伤活性1 。抗菌多肽与传统的抗生素,化学药物在作用机制上具有明显的差异, 其抗菌谱广,作用强且迅速,不易产生耐药等,这些优点,使抗菌多肽药物有望 成为最理想的抗菌药物; 近年来, 有关抗菌肽的研究越来越多, 学者们就抗菌肽 的分离纯化,氨基酸序列分析,抗菌肽作用机理研究,蛋白质结构与功能分析, 改造设计并合成新型抗菌肽, 动植物的转抗菌肽基因工程及抗菌肽基因工程等方 面做了大量工作 8 。1.1 抗菌肽的分类抗菌肽的分类方式有很多,分类依据不同,其分类结果也不同: (1)根据抗 菌肽来源的不同, 可以将
12、抗菌肽分为动物源抗菌肽, 植物源抗菌肽和微生物源抗 菌肽。动物源抗菌肽包括昆虫抗菌肽,哺乳动物抗菌肽,两栖类抗菌肽,节肢动 物抗菌肽,贝类抗菌肽,原索类抗菌肽,鸟类抗菌肽及鱼类抗菌肽等;植物源抗 菌肽种类繁多, 可来源于多种植物, 且存在于植物的各种组织中, 现已发现的植 物源抗菌肽有硫素, 转脂蛋白,knottin 类抗菌肽,植物防御素及橡胶蛋白类等; 微生物源抗菌肽包括病毒源和细菌源,现已发现的微生物抗菌肽有短杆菌肽 S, 多粘菌素,杆菌肽,乳链菌肽,多勃菌素 E 等1 。(2)根据氨基酸序列和二级结 构的不同,可以将抗菌肽分为 -螺旋型抗菌肽, -折叠抗菌肽, 具有环形结构抗 菌肽和伸展
13、性抗菌肽 1。(3)根据所带电荷的不同,可将抗菌多肽分为非阳离子 和阳离子两种抗菌肽 1。(4)根据抗菌蛋白的作用机制不同,可分为类亲环素蛋 白,葡聚糖酶,脂转移蛋白,核糖体失活蛋白, 2S 清蛋白类,蛋白酶抑制剂, 几丁质酶,类几丁质酶,防御素,类防御素蛋白等 1。1.2 抗菌肽的性质1.2.1 抗菌肽的一般理化性质抗菌肽的分子量很小,一般是由 30 多个氨基酸残基组成,最多不超过 50 个,大小在 10kD 以下;热稳定性高,通常在 100 下加热十几分钟仍能保持活 性;水溶性好;抗酸碱能力强,在强酸强碱的条件下都能保持较高的活性;具有 两亲性,大部分有阳离子特征;1.2.2 抗菌肽的生物
14、学特性传统的抗生素仅对细菌有作用, 而抗菌肽的抗菌谱广, 不仅对革兰阴性菌和 革兰阳性菌有抑制作用, 对真菌, 病毒及原生动物也有作用。 抗菌肽的生物学特 性包括( 1)抗菌活性;( 2)抗肿瘤活性,抗菌肽可以选择性的杀死肿瘤细胞, 而对正常细胞无损害作用, 这一特性使得抗菌肽有望成为抗肿瘤的潜力药物; (3) 抗病毒活性;(4)抗寄生虫活性;(5)免疫活性,抗菌肽能调节免疫活性。1.3 抗菌肽的作用机理对于抗菌肽的作用机制, 目前还没有一个统一的说法, 有的认为抗菌肽是通 过与细胞膜作用;有的研究人员认为抗菌肽是通过与细胞膜上的特异的物质作用; 有的认为抗菌肽是通过与细胞壁,线粒体等作用。具
15、体可归纳如下: (1)抗菌肽 通过改变细胞膜的通透性起作用,大多数抗菌肽属于阳离子型,且具有两亲-螺旋型或两亲 -折叠结构;两亲 -螺旋上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负 电荷通过静电作用,抗菌肽分子中的疏水端插入细菌质膜中,然后两亲性-螺旋也插入其中,从而破坏了质膜结构,最终由于渗透压被改变,细菌死亡。 (2) 抗菌肽通过对细菌胞内酶结构, 功能及对细菌胞内信号转导影响起作用, 抗菌肽 可直接作用于细胞质内的 DNA ,干扰细菌外膜蛋白的转录,从而抑制细菌的生 长,达到抑菌效果。 (3)抗菌肽直接与细胞壁作用。 ( 4)抗菌肽直接作用于线粒体。1.4 抗菌肽的制备方法目前,抗菌肽的制备方法有
16、生物材料提取, 化学合成法, 基因工程法和酶解 法 4 种方法获得。1.4.1 生物材料提取法小分子多肽的提取方法主要有: 中性盐沉淀法、 有机溶剂抽提法、 有机酸提 法等15。使用组织捣碎机将组织捣碎,组织捣碎完之后,再经超声波细胞破碎机 将细胞完全破坏, 细胞被完全破坏之后, 再使用乙酸浸提就可以获得一定的抗菌 肽;然后采用 SephadexLH -20 凝胶柱过滤层析, 分别将盐类和其他蛋白质分开, 再利用 RP-HPLC 对具有活性的 SephadexLH -20 凝胶柱收集物进行进一步的洗 脱纯化 17,18。通过天然生物中提取抗菌肽的工序为: 浸提,吸附,洗脱,盐析, 凝胶过滤,
17、离子交换层析和反向层析 16。生物材料提取天然抗菌肽的方法操作技 术简单,且原料来源广, 但由于天然抗菌肽数量极少, 使提取的样品量无法达到 生产应用的需求,只能用于实验研究。1.4.2 化学合成法化学合成法是在已知抗菌肽的氨基酸序列之后, 通过人工合成的方式将氨基 酸残基连接起来。 通过研究, 此种方法可以将抗菌肽的某些氨基酸进行删除或替 换,使抗菌肽的抗菌效果更好; 但对合成的肽链长度有限制, 而且需要用到大量 的有机溶剂;所以化学合成法制备抗菌肽成本较高,进行产业化生产还很困难。1.4.3 基因工程法基因工程法是通过从基因组中分离获得抗菌肽的目的基因, 然后将这段基 因克隆复制, 再将其
18、与选好的载体连接构成重组质粒, 用一定的方法将重组质 粒转移到受体菌中并诱导重组质粒在受体菌中表达,从而获得抗菌肽的过程。 基因工程法制备抗菌肽可以获得大量的抗菌肽产物, 且成本较低; 但是通过基 因工程法制备的某些抗菌肽的二三级结构可能与天然抗菌肽有一些差别, 致使 抗菌肽的抗菌活性有所下降,同时,某些抗菌肽还会杀灭受体菌;因此,用此 方法制备抗菌肽还有一定的困难,还需要解决一些难题。1.4.4 酶解法酶解法是通过食品级酶对某些利用率或生物效价不高的农副产品的蛋白 质进行水解获得抗菌肽 16。利用蛋白水解法制备抗菌肽,其操作简单,条件容 易控制, 并且经济环保, 目前已有研究者通过此种方法制
19、备出了抗菌肽, 比如 袁永俊等 19已经用蛋白水解法制备出了酪蛋白抗菌肽。 蛋白水解法制备抗菌肽 是比较理想的方法,尽管如此,蛋白水解法也有不足之处:首先,这种方法很 受蛋白酶本身的影响; 其次,水解过程中产生的副产物会使纯化效率降低, 导 致产物量降低,抗菌肽纯度降低。综上提到的四种制备抗菌肽的方法, 各有优缺点; 其中,基因工程法以及 酶解法是最有发展前景的,也是最有研究价值的。1.5 抗菌肽在各方面的应用前景及目前存在的问题抗菌肽具有抗菌谱广,耐受性好,不易产生耐药性等优点,因此,抗菌肽 有很大的发展前景。 在研究中, 抗菌肽不仅在医疗方面被看好, 在其他领域比 如食品,畜牧业和转基因方
20、面也有传统抗生素无法替代的优越性。 尽管现已证 实抗菌肽药物有不可替代的抗菌优越性, 但真正要将抗菌多肽药物推向市场还 存在很多问题。首先,抗菌肽的研究历史不长,所以很多资料缺乏,用药的安 全性无法得到保证。其次,抗菌肽的来源也是一个需要解决的问题。1.5.1 抗菌肽在医疗方面的应用自从青霉素被发现以来, 抗生素的滥用越来越严重, 其产生的耐药性也越 来越受到重视;在此情况下,抗菌肽因为本身分子量小,热稳定性高,抗酸碱 能力强,能广泛抗菌, 不产生耐药性等特点, 使其在抗菌方面有得天独厚的优 越性,很多学者已经在研究抗菌肽的临床应用价值。 目前, 在抗菌肽的数据库APD中已经发现了 2400
21、多种抗菌肽;国际上很多知名药厂已经在研究和开发 抗菌肽类的新药,虽然由于抗菌肽药物的研究时间比较短,资料也还有欠缺, 很多药物也仍在 FDA审批程序中,但某些新药已经取得了良好的临床试验。1.5.2 抗菌肽在食品方面的应用如今,食品防腐剂用量逐渐增大, 越来越多的食品防腐剂被证实存在安全 隐患,天然的食品防腐剂越来越备受青睐。 抗菌肽由于其低毒性, 易被消化水 解,具有良好的水溶性和稳定性, 可作为天然的防腐剂。 抗菌肽可以加入食品 中来制作各种功能性食品, 可以制成保健营养品; 同时, 抗菌肽可以作为食品 质量的增效剂 20 。1.5.3 抗菌肽在禽畜养殖业方面的应用饲料中添加抗生素能抑制病
22、菌的繁殖, 随着抗生素的滥用, 在饲料中添加 抗生素也出现了很多问题, 比如药物残留较严重, 影响了禽畜产品质量和人体 健康等。而抗菌肽由于具有抗菌谱广, 抗菌机制独特,不易产生耐药性等特点, 这些优点,使抗菌肽成为新型饲料添加剂宠儿。1.5.5 抗菌肽研究存在的问题随着抗菌肽研究的深入, 抗菌肽的其他应用也被发掘; 尽管越来越多地研 究证明抗菌肽具有广泛的用途,但是抗菌肽走向市场还有很长的一段路要走, 目前仍存在一些问题需要解决: 1)抗菌肽毒理性和药理药效的研究数据极少, 在食用计量,给药方式以及作用时间还需要作进一步的研究。 2)抗菌肽的制 备问题。天然抗菌肽的含量极低,且提取工艺复杂,
23、致使产率极低;利用化学 合成法制备除了成本高之外, 无法保证抗菌肽的结构和活性; 基因工程技术制 备抗菌肽由于抗菌肽对工程菌有抑制作用, 所以抗菌肽的表达效率较低; 酶解 法制备抗菌肽不仅资源有限, 其纯化也是一个问题。 随着多肽及蛋白质的化学 结构越来越多地被人们所了解, 人工合成目的肽和蛋白质的手段在研究当中比 较常见, 原因是这种方法比较快速, 但是这种方法很昂贵, 一般只用于研究领 域。由于成本太高, 难以达到产业化的规模。 目前抗菌肽的制备已经成了抗菌肽研究的一大难题1.6 基因工程制备抗菌肽简介抗菌肽的制备是研究抗菌肽的一个难题, 通过研究发现, 基因工程技术和 微生物发酵是抗菌肽
24、规模化生产的有效途径, 不仅能降低成本, 还不受天然资 源少的限制, 且废液处理的工艺较成熟。 目前许多研究者都在研究基因工程制 备抗菌肽, 但是通过基因工程表达抗菌肽还存在一些问题: 比如有些抗菌肽对 宿主菌有毒性作用, 会抑制宿主菌的生长, 从而降低了抗菌肽的表达; 另外通 过基因工程表达出来的有些抗菌肽产物会被基因工程菌的蛋白酶降解, 从而影 响了产量。 针对这两个问题, 国内外的学者提出了一些解决方案, 一方面从分 子角度设计并改造抗菌肽, 另一方面从制备重组抗菌肽的角度优化抗菌肽的表3达。1.6.1 抗菌肽分子设计及改造策略抗菌肽除了制备生产方面的问题之外, 还有药理方面的问题, 抗
25、菌肽要想 取代抗生素的位置还需要克服很多困难; 通过研究发现, 抗菌肽的抗菌活性还 存在一些问题, 尽管有少数的抗菌肽进入临床试验阶段, 但临床研究中发现抗 菌肽还存在着许多问题,比如毒性强、稳定性差、成本高、选择性差等。 研 究者们对抗菌肽进行分子设计, 结构改造和修饰,发现可以降低抗菌肽的毒性, 增加其稳定性和选择性。 在天然的抗菌肽数据库中, 可通过序列结构的同源性 比对来分析并确定残基的保守模式(疏水性、电荷数及其电性、极性等) ,从 而得知模板序列 3 。或选择天然活性较强的抗菌基因作为模板序列,在优良的 母板序列的基础上, 通过对肽链的氨基酸残基设计、 肽片段的拼接设计、 肽链 的
26、环合设计、 计算机辅助设计、 靶向设计及模拟生物模型设计改造抗菌肽, 是 获得新型抗菌肽的有效途径 3 。1.6.1.1 氨基酸残基的设计抗菌肽的生物活性一定程度上受抗菌肽所带的电荷, 两亲性氨基酸的影响; 通过增加肽链的正电荷数, 改变两亲性氨基酸的比例及替换氨基酸残基, 对抗 菌肽的组合设计与筛选是有帮助的。 一定范围内抗菌肽的抗菌活性会随着正电 荷数的增加而增加, 增加到某一个值后便不再增加, 猜测可能是因为过多的正 电荷导致抗菌肽与磷脂头部牢固结合, 使抗菌肽的穿膜效率下降; 同时,正电 荷数在超过临界值后致使抗菌肽分子间静电斥力大于抗菌肽分子与膜的静电 引力,阻碍了膜上抗菌肽分子的聚
27、集和穿膜孔道的形成, 从而降低了抗菌活性 即膜裂解能力 。马清泉等通过在螺旋轮的亲水面设计精氨酸,疏水面设计亮 氨酸和缬氨酸获得了具有良好活性的新型抗菌肽 LGG163 。通过 Frecer 等的试 验证明选择性地用亲水性更强的氨基酸残基替换疏水面的部分氨基酸残基可 以降低其溶血活性, 同时对抗菌活性没有影响, 此外, 增加极性面的亲水氨基 酸残基可增强其抗菌活性 3 。1.6.1.2 肽片段拼接设计由蛋白质工程和酶工程生产杂合蛋白和杂合酶的研究思路, 研究者们进行 拼接设计, 通过分析不同抗菌肽的理化性质和活性, 截取不同的功能区域, 从 而获得毒副作用更小、 活性更高的杂合肽 3 。 目前
28、成功的有抗菌肽 CecropinA 和 Melittin 的拼接,其杂合肽不仅抗菌活性增强, 蜂毒肽 Melittin 的溶血活 性也降低了。另外,李国栋等将抗菌肽 CecropinAl 的 N 端(KWKLFKKI)与鸡源 抗菌肽 Cathelicidin-2(CATH-2) 拼接后所得的抗菌肽,大大缩减了抗菌肽的 最小抑菌浓度 21 。1.6.1.3 肽链的环合设计维持肽链结构的稳定性, 可通过肽链的环合, 环合后的肽链对由宿主菌分 泌的蛋白酶的抵抗力增强。 有些线性的抗菌肽容易被血浆内的酶降解, 将其环 合后,不仅肽链的稳定性增强了, 而且其抗疟疾及抗肿瘤的活性提高及毒性作 用降低;目前
29、研究者们研究成功的有 KLK2,鸡源抗菌肽 CATH-2等。1.6.1.4 计算机辅助设计王远强通过计算机辅助设计, 在对优势位点、 保守残基及优势氨基酸的分 析的基础上,结合 2D-QSAR和 3D-QSAR结果建立了 QSAR模型,在理论上筛选 了活性较好的多肽,再通过试验验证 22 。 谢秀枝等通过对抗菌肽 CaseicinA 氨基酸排列顺序重排得到 20 种突变体,而且从中筛选获得了比原始抗菌肽活 性更高的序列 24 。1.6.1.5 靶向设计近年来,靶向性设计抗菌肽变异体在抗菌肽药物的研发方面优势比较大, Ecert 等开发设计了选择性抗菌肽 STAMP技术3 。这种技术的关键是利用
30、一个灵 活的连接体将 AMP区域与一个靶向定位区域连接起来, 其机制是通过靶向定位区 到达致病菌表面, 而 AMP区域负责破坏致病菌细胞膜, 最终消灭致病菌, 而对其 非致病菌无作用 3 。因特异性靶向抗菌肽不同的区域 , 其识别位点不同,从而提 高消灭病原微生物的选择性, 如治疗肿瘤的较好的选择是具有免疫识别与杀菌的 抗体药物或其络合物,毒性、电荷、疏水性、外激素受体或抗体、抗体可变区和 信息素等是影响靶向区域与病原微生物结合的因素。 此外,有些致病菌在生长过 程中会改变其周围的环境, 改变后的环境易引起其他致病菌的生长。 如果设计出 能感应环境变化并能发挥相应作用的抗菌肽, 就能够特异性地
31、抑制或消灭致病菌 的繁殖,保护正常菌群,这将是预防和治疗致病菌的新方法 3 。已有研究者构建 出了对酸碱度敏感的选择性抗菌肽, 且发挥了作用; 因此, 设计靶向性环境感应 型抗菌肽是未来抗菌肽研发的一个方向。1.6.1.6 模拟生物模型设计模拟生物模型随着生物技术的发展显得越来越重要, 为从膜的作用机制的 角度探索抗菌肽对靶细胞膜的影响提供了一定的理论基础, 因此能更好地设计 并获得抗菌肽。 为验证抗菌肽对靶细胞膜的穿透效率; 唐文婷通过模拟细胞膜 法对抗菌肽进行筛选分离, 发现模拟细胞膜的构成脂质、 疏水性不同的烃基链 及电荷性各异的极性头决定了不同磷脂双分子层对抗菌肽的辨识度和亲和性, 进
32、而影响筛选的结果 25 。黄金丰以一个典型螺旋型膜活性多肽为模型研究 其对不同细胞膜的构效关系, 发现多肽满足物理化学条件要求时, 对细胞膜位 点的结合能力更强 26 ;冉瑜为了研究构象不同的抗菌肽与膜的结合能力, 设计 了含有单活性序列的短链肽、 含有双活性序列的环形肽与线性肽, 结果发现双 活性序列的环形肽和线性肽更易与磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油作用, 单活性序列 基本上不反应,因此推测单活性序列可能是通过与细胞内的靶点作用而起到杀 菌的效果 27 。由以上可以看出, 在预测和检测抗菌肽的作用效果方面, 模拟生 物膜技术可以为其提供参考。1.6.2 目的基因的获取目的基因的获取方法有:一从基因
33、文库中获取;二通过人工合成 ;三 PCR 技术扩增目的基因。 在研究早期, 一般是以构建文库或以 DNA或 RNA为模板使用 PCR技术扩增获得,但这两种方法很费时间和精力;用在生产过程中显然是不可 行的。随着 DNA合成仪产生, 人们就可以使用 DNA合成仪合成自己需要的目的核 苷酸片段; 这种方法不仅能快速获得任意核苷酸序列的目的基因片段, 而且还可 以节省时间和精力。 抗菌肽编码基因的 cDNA片段较小,通常仅有几百 bp 甚至几 十 bp,因此,通过人工方法直接合成抗菌肽的 cDNA的编码基因,同时在两端引 入粘性接头用于构建表达载体, 减少了基因片段的损失, 简化了基因工程操作过 程
34、。因此,直接根据抗菌肽氨基酸序列和研究目的并借助计算生物学手段优化设 计其 cDNA编码序列,采用人工方法合成获得其基因片段,然后直接构建表达载 体不失为一种简便快捷而又有效的方法 7 。1.6.3 制备重组抗菌肽目前,只有不到百分之二十的重组抗菌肽没有采用原核表达系统制备 28,尽管如此,原核表达系统也还存在一些问题。 首先,原核表达系统表达抗菌肽后, 易被抗菌肽抑制其生长,甚至被杀伤而死亡,其次,不管是在表达过程中,还是 在表达过程后,抗菌肽的稳定性也是一个值得关注的要点。 研究者通过研究发现, 解决这两个问题的最好方法是通过抗菌肽与融合标签共同表达。1.6.3.1 融合表达抗菌肽融合表达
35、可以暂时改变抗菌肽的构象而降低其对原核表达系统的作 用,表达的产物需要酶或化学试剂裂解、 纯化后才具有活性, 然而融合表达系统 中的融合标签的作用是至关重要的。 目前,根据融合标签的功能, 可将融合标签 分为促进蛋白可溶的分子伴侣和促进包涵体形成的分子伴侣两种, 第一种比如谷 胱甘肽转移酶 GST、泛素相关小蛋白修饰 SUMO及硫氧还原蛋白 Trx ,第二种的包 涵体不易分离,所以常与与弹性蛋白或丁酯结合的结构域亲和标签结合使用 29 。 近年来,也有研究者在进行重组蛋白表达的研究时采用的自体蛋白酶是带有自动 剪切功能的,但切割效率不高。1.6.3.2 串联表达抗菌肽的分子很小,克隆、表达、分
36、离、纯化和检测工序都很繁琐,且回收 产率较低,抗菌肽串联表达不仅提高抗菌肽的回收效率,还能保持抗菌肽活性、 降低对宿主细胞作用, 即增加了抗菌肽的稳定性和表达量; 为了便于识别、 分离 串联表达的肽聚体, 需要在各条肽基因间加上具有裂解特性的基因序列, 以表达 出可识别的短肽片段,方法有:非酶类裂解点;内肽酶切位点; 混合使 用肽的切割点 3 。第二章 抗菌多肽的制备工艺目前,抗菌肽的制备可以通过生物材料提取, 化学合成法, 基因工程法和 酶解法 4种方法获得;这四种方法制备抗菌肽, 都存在一些问题。 生物材料提 取天然抗菌肽的方法操作技术简单, 且原料来源广, 但由于天然抗菌肽数量极 少,使
37、提取的样品量无法达到生产应用的需求, 只能用于实验研究。 化学合成 法对合成的肽链长度有限制, 而且需要用到大量的有机溶剂; 所以化学合成法 制备抗菌肽成本较高, 进行产业化生产还很困难。 基因工程法制备抗菌肽可以 获得大量的抗菌肽产物, 且成本较低; 但是通过基因工程法制备的某些抗菌肽 会杀灭受体菌; 因此,用此方法制备抗菌肽还有一定的困难, 还需要解决这些 难题。酶解法很受蛋白酶本身的影响; 其次,水解过程中产生的副产物会使纯 化效率降低, 导致产物量降低, 抗菌肽纯度降低。 尽管四种方法都有各自的缺 点,但通过比较会发现, 基因工程法制备抗菌肽是最具有发展潜力, 本文以基 因工程法为基础
38、, 设计一个比较合理的、 能合成大量抗菌肽、 并且成本相对比 较低的抗菌肽的制备方法。2.1 目前抗菌多肽的生产方法抗菌肽研究起步于 20世纪 80年代,可以从昆虫、动物、植物、微生物等生 物中分离得到, 也可以通过化学合成法直接合成, 还可以使用基因工程法通过宿 主表达。抗菌肽经过几十年的研究发展, 出现在市场上的成品已经有很多, 给生 产生活带来新的变化和发展。 而目前进入市场的抗菌肽主要是生物材料提取法和 基因工程法制备而成的, 基因工程法因其不受原材料缺乏的限制以及生产成本较 低而备受青睐,目前使用基因工程法制备抗菌肽的工艺流程如下:图1 基因工程法制备抗菌肽的流程图这种基因工程法制备
39、抗菌肽, 使用了融合表达策略, 解决了表达的抗菌肽抑制宿主菌生长这一问题, 同时还简化了抗菌肽的纯化分离; 但是这种方法制备抗 菌肽需要在已知抗菌肽基因序列的基础上进行。2.2 抗菌肽制备改造设计对于抗菌肽制备工艺设计这部分, 通过阅读文献, 以基因工程方法制备抗 菌肽为基础,根据其他研究者的研究、 NCBI 数据库及 APD数据库为依据,设 计一个比较合理的、 能合成大量抗菌肽、 并且成本相对比较低的抗菌肽的制备 方法。本文在对抗菌肽进行规模化生产之前先筛选出优异的抗菌肽, 筛选的方 法是先通过生物信息学和统计学工具优化抗菌肽结构参数, 根据大肠杆菌的密 码子偏爱性将抗菌肽的基因序列替换成大
40、肠杆菌偏爱的密码子, 根据稀有密码 子的存在会影响抗菌肽的表达产量, 将稀有密码子替换成其他的密码子或将稀 有密码子剔除,应用计算机软件辅助对已改造好的抗菌肽基因进行初步筛选, 然后再人工合成抗菌肽, 经分离纯化后对合成的抗菌肽进行结构检测和抗菌活 性的检测, 从而筛选出抗菌活性较好的基因序列, 筛选出来的优异基因再使用 基因工程法规模化生产出来,最后检测其是否具有生物学活性。2.2.1 抗菌肽改造的原因使用基因工程法制备抗菌肽, 融合表达策略, 解决了表达的抗菌肽抑制宿主 菌生长这一问题, 同时还简化了抗菌肽的纯化分离; 但是这种方法制备抗菌肽需 要在已知抗菌肽基因序列的基础上进行。 对于有
41、些抗菌肽, 其基因序列里不仅含 稀有密码子, 而且还可能含有一些能使抗菌肽表达产量降低的核苷酸序列, 这个 方法制备出来的抗菌肽的产量就会不理想; 但是当我们对抗菌肽的基因进行一些 改编之后, 不仅会使抗菌肽的生物学活性更好, 还大大提高了抗菌肽的产量。 比 如, 1)在进行抗菌肽制备时,如果选用大肠杆菌做表达系统,由于大肠杆菌对 某些密码子具有偏爱性, 当我们适当增加大肠杆菌偏爱的密码子后, 会发现抗菌 肽的表达产量提高了。 2)如果基因序列含稀有密码子时,就会影响抗菌肽的表 达,当我们把基因序列中的稀有密码子替换或剔除时, 抗菌肽的表达产量也提高 了。因此,我们在使用基因工程制备抗菌肽的时
42、候, 如果先对抗菌肽基因进行研 究,然后把那些影响表达的密码子除去或替换成能提高产量的密码子, 或适当增加表达系统偏爱的密码子,那么,将会大大提高抗菌肽的产量。2.2.2 抗菌肽改造的方法对抗菌肽的改造就是根据数据库查询抗菌肽的信息和稀有密码子及大肠杆 菌的密码子偏爱性, 然后通过计算机辅助设计, 在对优势位点、 保守残基及优 势氨基酸的分析的基础上,结合 2D-QSAR和 3D-QSAR结果建立了 QSAR模型进 行初步的筛选, 在理论上筛选了活性较好的多肽, 再通过试验验证。 将计算机 筛选出的抗菌肽人工合成, 合成的抗菌肽经分离纯化后进行结构检测和抗菌活 性的检测,从而筛选出具有抗菌活性
43、最好的抗菌肽基因序列。2.2.3 抗菌肽改造的依据整个改造的方法是以数据库作为理论依据,以其他研究者的研究内容为参 考,因此具有一定的可行性。图 2 抗菌肽的筛选2.3 抗菌肽的筛选2.3.1 通过生物信息学工具优化抗菌肽结构参数生物信息学是一门以计算机为基础研究生物学的学科, 主要进行生物数据的 序列测定以及分析等 30 。欧洲生物信息学研究所 ( EBI) 、 日本生物信息学中 心 ( CBI) 和美国国立生物技术中心 ( NCBI)是目前国际上的三个主要的蛋白质和 核苷酸的公共数据库 30 。生物信息学主要进行的是蛋白质结构预测、 系统发育分 析和序列对比 30 。利用 NCBI数据库,
44、运用生物信息学方法对植物抗菌肽的分类、 跨膜区域、平均疏水性、亚细胞定位、信号肽等方面进行简要分析及预测。随着 抗菌肽研究的不断深入和生物信息学的不断发展, 应用生物信息学方法分析与预 测抗菌肽也会取得更大的发展空间, 利用软件预测抗菌肽结构特点的不同对抗菌 肽活性的影响, 及人工设计并合成杂合肽成了抗菌肽研究的一个热点。2.3.2 抗菌肽的合成、纯化2.3.2.1 抗菌肽的合成抗菌肽的合成使用固相合成方法, 固相合成法可以在一个反应容器中进行完 所有的反应,操作简单,便于自动化管理,产物易分离,要想提高产物量,可以 通过加入过量的反应物。 固相法合成抗菌肽是以氯甲基聚苯乙烯树脂作为固相载 体
45、,使用三氟乙酸脱掉氨基的保护基从而将氨基酸接到固相载体上; 然后再使用 DCC(N,N- 二环己基碳二亚胺)活化氨基酸使其相互反应形成肽键,合成完成 后使用 HF来水解合成好的肽链与固相载体之间的脂键,就可以得到独立的合成 好的抗菌肽。2.3.2.2 抗菌肽的纯化抗菌肽的纯化是比较复杂的一个过程, 我们需要在保证抗菌肽生物活性的前 提下纯化抗菌肽, 可以说, 这是制备抗菌肽的一个关键点; 但是对于天然的抗菌 肽,一般是先进行超速离心除去大分子杂蛋白, 再进行纯化分离; 使用的是层析 法和高效液相色谱法 (HPLC),采用半制备型 HPLC将制备好的抗菌肽进行进一步 的分离纯化,收集洗脱峰并进行
46、浓缩,方便后面的鉴定。2.3.3 抗菌肽的活性检测对于抗菌肽的活性检测,选用 TTC(氯化三苯四氮唑)微量稀释法, TTC是 一种氧化还原色素,可作为氢受体被细菌脱氢辅酶上得氢还原,由无色的 TTC 变成红色且不溶于水的三苯甲腙 13 。将1的吧 TTC加入已纯化的抗菌肽中,使 TTC的终浓度低于 0.005mg/ml (TTC在高浓度时对某些细菌有明显的抑菌作用) 13 。将处于对数期的细菌(比如金黄色葡萄球菌,大肠杆菌或铜绿假单孢菌等) 在适宜的条件下放置 LB 液体培养基中培养一段时间。取一定量的菌液稀释数倍 后接种于 LB 无抗固体平板,先培养半小时待菌液吸收完全后用打孔器打孔,将 含
47、 TTC的纯化的抗菌肽注入孔内, 适宜温度下培养 (根据细菌的生长条件) 一定 时间后观察。根据是否变红来判断抗菌效果,若变红,则抗菌效果不理想;若未 变红,则抗菌效果好。2.3.4 抗菌肽的结构检测抗菌肽的结构分为一级结构和高级结构, 一级结构可送去检测机构进行检测, 目前国内已经有很多检测机构能够测定氨基酸的序列。 因此可将抗菌肽送去相关 机构检测一级结构。高级结构的测定可以有两种方法: 1)理论方法,使用软件 和数据库,将一级结构输入,通过建立模型和理论来确定高级结构。 2)实验方 法,通过 X- 衍射和核磁共振等方法来确定高级结构。为了节约成本,选择使用 理论方法进行二级结构的检测。研
48、究发现,一些特殊的氨基酸和肽链的长度会影响抗菌肽的抗菌活性, 主要 是通过影响其疏水性、 二级结构以及抗菌肽在溶液或膜上的状态; 抗菌肽所带静 电荷及疏水性影响其与膜的结合能力, 从而影响抗菌活性。 但一般认为这是正电 荷,而对于负电荷的机制还不清楚。图 1 基因工程法制备抗菌肽的流程图2.4 宿主菌的育种车间工艺流程及主要设备2.4.1 主要设备以及用途:DNA合成仪 2 台,分别用于合成目的基因与表达载体。保温罐 1 个,用作反应器分别对目的基因和表达载体进行双酶切,双酶 切后加热在高温下一段时间,使限制性内切酶失活。配料罐 2 个,用作培养基,一个用于原料的配制和稀释,另一个用于含 特殊
49、营养物质的培养基配制和稀释。瞬时灭菌器 3 个,用作培养基加热灭菌。微生物液体连续培养器 3 个,用作宿主菌的不同培养,包括激活培养,转 化培养及筛选培养。2.4.2 制备基因2.4.2.1 制备目的基因稀有密码子对基因表达有一定的影响, 通常情况下, 会降低抗菌肽基因的表 达水平。而大肠杆菌基因对密码子的使用有一定的偏爱性 ; 根据这种偏爱性,可 以将稀有密码子替换成表达宿主偏爱的密码子。 根据密码子偏爱性和碱基比例设 计抗菌肽基因,使用 DNA合成仪合成 ,为了减少基因片段的损失,简化基因工 程操作过程,根据已设计好的核苷酸序列, 同时在两端引入粘性接头用于构建 表达载体。2.4.2.2
50、制备载体基因使用 DNA合成仪合成合成两条反相互补的寡核苷酸链 , 在两条引物的 5端 分别引入两个限制性酶切位点 , 并在目的片段上游引入羟胺切割蛋白位点 8。2.4.3 构建重组表达载体向表达载体质粒中加入两个限制性酶进行双酶切, 混匀之后在适合的温度下 水浴加热一段时间; 同时合成好的目的基因也是在相同的条件下进行双酶切。 这 里如果想要缩短酶切时间,可以加入一点 Fast Digest Buffer 。双酶切后分别 将反应体系在高温下使限制性内切酶失活。2.4.4 目的基因片段与载体的连接回收后的表达载体与目的基因片段在加入在加入高效连接DNA酶之后混匀,在室温下反应半小时左右。2.4
51、.5 宿主菌的制备宿主菌的制备包括宿主菌的选择、保存以及制备。2.4.5.1宿主菌的选择 使用基因工程制备抗菌肽需要在宿主细胞内表达抗菌肽, 而目前所使用的宿 主表达有在大肠杆菌中表达,酵母菌中表达,昆虫 / 杆状病毒表达系统和转基因 动植物中的表达 8 。由于大肠杆菌表达系统具有产量高, 生长快速,操作简单, 目的基因导入容易方便,成本低等优点,因此选择大肠杆菌为宿主菌。2.4.5.2 宿主菌的保存宿主菌选大肠杆菌, 在进行生产之前, 大肠杆菌应保存在真空冷冻干燥状态 下,在此状态下, 大肠杆菌内的酶活性均已被抑制, 为此大大降低了菌种的变异 速度。一般是保存在 -80 左右的冰箱或或液氮中,在此温度下加入甘油能减少 冰晶形成,且甘油对细菌无毒性。2.4.5.3 菌种的制备 从低温的环境下取出保存好的大肠杆菌,接种到无抗生素的液体培养罐中, 培养罐中加有 NaCl、蛋白胨、酵母提取物等营养物质,使用去离子水溶解、并 用 NaOH调节 PH,接种大肠杆菌
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