丙二醛MDA测定

1、丙二醛 MDA 、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD ）的测定丙二醛 MDA 测定测试所需仪器设备：可见光分光光度计，可调到 95C左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入， 用来代替水浴箱）。离心机。100 T试剂盒组成与配制：试剂一：液体 20mL*1 瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前 适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用） 。试剂二：液体12mL*1瓶，用时每瓶加340mL双蒸水混匀，4C冷藏。 试剂三：粉剂*1支，4C冷藏。1. 按规范操作方法来配制 MDA号试剂：将1支100 T的MDA号粉剂倒入烧杯内加90C100C的热蒸

2、馏水64mL,充分溶解（溶解过程中可适当加热）。冷却后加冰醋酸60mL混匀。2. 再将上述配好的MDA号试剂用50%冰醋酸按2： 1进行稀释， 用多少配多少。例如您需要用微量法测MDA需要试剂三为15mL则可以取上述按规范操作法配好的试剂三10mL加冰醋酸5mL混匀即可。配好的试剂避光4 C冰箱冷藏（冰醋酸自备）注：因蒸馏水热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加60mL现多加4ml,冷却后在60mL50%冰醋酸的配制是50mL双蒸水加50mL冰醋酸混合而成的 冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为 99%以上。用时将粉剂加入到90C100C的热双蒸水

3、60mL中,（在溶解过 程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至 60mL再加冰醋酸 60m,混匀，配好的试剂避光冷藏。冰醋酸自备。标准品：10nmoL/mL四乙氧基丙烷5mL*1瓶，4C冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。操作步骤:标准管标准空白管测定管测定空白管*10nmoL/mL标准品(mL)a*无水乙醇（mL）a*测试样品（mL）a*a*试剂一（mL）a*a*a*a*混匀（摇动几下试管架）试剂二（mL）1.51.51.51.5试剂三（mL）1.51.51.550%冰醋酸(mL)1.5旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95 C水 浴（或用锅开盖煮沸40分钟），取出后流水

4、冷却，然后35004000 转/分，离心10分钟，取上清* , 532nm处，1cm光径，蒸馏水调零， 测各管吸光度值。a*表示所取的样品量，标准品量，无水乙醇的量、试剂一的量，四者 均相等，例如样品取0.1mL，则标准品、无水乙醇及试剂一也取0.1mL,若样品取0.2mL,则标准品、无水乙醇及试剂一也取 0.2mL。 因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结果不受影响。* 一般情况下，标准管、标准空白及测定空白管每批只需做 12 只，若测定管中蛋白量不是太高，则测定空白管可以不测，用标准空 白管来代替测定空白管。*吸取上清比色时了好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免 倾倒，以免沉淀进入比色皿，

5、影响吸光度。注1.用此方法，所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响 最终结果。注2. 5%组织匀浆a*取0.10.2mL进行检测较好。注3.若发现检测样本吸光主葢低，可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但您的同一课题中 MDA的检测都必须延长至80分 钟，以免造成批间差异。注4.此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1mL时，则标 准管吸光度减去标准空白管吸光度为 0.103 0.112。当标准品 取样量为0.2mL时，则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为 02060.224。计算公式1. 计算公式:(1)血清中MDA含量计算公式:血清中MDA含量(nmoL/mL)测定管吸光度-

6、测定空 标准管吸光度-标准空白管吸光度白管吸光度标准品浓度(10nmoL/mL)样本测试前稀释倍数(2)组织中MDA含量计算公式:组织中 MDA含量(nmoL/mgprot)*测定管吸光度-测定空 标准管吸光度-标准空白管吸光度白管吸光度标准品浓度(10nmoL/mLL蛋白含量(mgprot/mL)*nmol/mgprot为纳摩尔/毫克蛋白超氧化物歧化酶（SOD）测试盒100管试剂盒的组成与配制试剂一：贮备液： 10mL*1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出， 需热水浴溶解后再用） ，试剂一应用液的配制：用时每瓶加 蒸馏水稀释至100mL, 4C保存。试剂二：液体10mL*1瓶，4C10C保

7、存。试剂三：液体10mL*1瓶，4C10C保存。试剂四：液体350卩L*2支，4C保存，不可冷冻；4号稀释液10mL*1瓶，4 C保存。用时二者按 1： 14稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4C保存，不可冷冻。配好后可保存 23个 月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。试剂五：粉剂*1支，用时加70C80C热双蒸水75mL配好后的试 剂避光4C冷藏。试剂六：粉剂*1支，用时加蒸馏水75mL溶解后备用，配好后的试剂避光4 C冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五：试剂六：冰乙酸=3： 3： 2的体积比配成显色剂，4C冷藏。操作总SOD（T-SOD活力的测定:试剂测定管对照管试剂一（

8、mL）1.01.0样品（mL）a*蒸馏水（mL）a*试剂二（mL）0.10.1试剂三（mL）0.10.1试剂四（mL）0.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置 37 C恒温水浴40分钟显色剂（mL）22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏 水调零，比色。计算（一）血清总SOD活力计算：1. 定义：每毫升反应液中SOD抑制率达 50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2. 血清总SOD活力计算公式：对照管吸光度-测定管吸光度.总SOD活力（U /mL）50%反应体系的稀释倍数对照管吸光度样本测试前的稀释倍数3.计算举例:测血清中总SOD的活力，取血清30卩L

9、,测定对照管吸光度为0.465,测定管吸光度为0.298。将数据代入计算公式:T - SOD活力（U /mL）=0.465 -0.2980.465亠50%3.33（反应液总量）0.03（所取样品量）= 79.73U/mL （活力单位/毫升）（二）组织匀浆中总SOD的活力计算:1.定义：每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2. 计算公式:组织匀浆中SOD活力U /mgprot）=对照管吸光度-测定管吸光度对照管吸光度-：-50%反应量体节组织中蛋白含量（mgprot/mL）3计算举例：取1%肝组织匀浆10卩L测总SOD的活力，对照管吸光

10、度为0.510, 测定管的吸光度为0.242,测得组织蛋白为1.075mg/mL。 则计算结果为：总 SOD活力（U /mgprot）二 0.510 - 0.242 一：一 50% 鲤 1.0750.5100.01二 323.60U /mgprotMgprot为毫克蛋白数总抗氧化能力的测定所需仪器设备721或722分光光度计、水浴箱测试盒组成与配制：（50T）试剂一：液体60mL*2瓶，4C保存。试剂二：粉剂*2支，用时每支加双蒸水至120mL室温保存。试剂三：黄色贮备液10mL*1瓶，避光冷藏保存。贮备液的稀释液60mL*1 瓶。试剂三应用液的配制：临用前取贮备液以稀释液稀释，比例为1： 1

11、9。需多少配多少。试剂四：溶液24mL*1瓶，室温保存。试剂五：溶液24mL*1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。简便操作表1.混合试剂的配制：测试前，将试剂一、二、三每种试剂所用量乘以 样本数（n）再乘以2 （因每只测定管均需做对照管），然后 再加上放宽的4只，即n*2+4,混合试剂的具体配制见下表：试剂名称试剂一试剂二试剂三试剂用量（mL）(n *2+4) *1(n *2+4) *2(n*2+4) *0.5将上面所有试剂按顺序加在一起混匀制成混合试剂。混合试剂需现用现配。2血清、全血简便操作表:对照管测定管待测样本（mL）a混合试剂（mL）3.53.5旋涡混匀器充分混匀，37C水浴30分钟试剂四（mL）0.10.1待测样品（mL）a*旋涡混匀器充分混匀，放