人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达重点

1、人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表 达人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达中华微生物学和免疫学杂志 1999 年第 1 期第 19 卷 出血热单位：侯颖春（ 710032 西安， 白雪帆 许国双作者：侯颖春 杨为松 白雪帆 许国双 李光玉第四军医大学西京医院老年病科）；杨为松李光玉（第四军医大学唐都医院传染病科）关键词：噬菌体；抗体；汉坦病毒； DNA单链；免疫球蛋白可变区【摘要】 目的 为了获取人源性HFRS基因工程抗体。方法 直接从人 体PBL构建人全套ScFv、VH噬菌体表面呈现文库，以panning方法筛至四级文 库，以ELISA方法鉴定各克隆抗汉坦病毒活性。结果

2、获得了 14个ScFv阳性克隆和11个VH阳性克隆。其中ScFv最高阳性克隆A410值为0.44, VH最高阳 性克隆A410值为0.50。对最高阳性克隆进行了测序分析，证明连接和克隆正 确，获得了抗HTV人源性ScFv和VH抗体的基因片段。克隆再转化于 HB2151 菌株，成功地进行了分泌型抗体片段的表达。 结论 采用噬菌体抗体库技术直 接从人体克隆人源性汉坦病毒噬菌体抗体可行，对HFRS的防治有一定的实际意义。Selecting, sequencing and expressing of the human phage antibody fragments against HTVHOU Y

3、ingchun*, YANG Weisong, BAI Xuefan, etal.*Department of Geriatrics, Xijing Hospital,Xian 710032【 Abstract 】 Objective To obtain the genetic engineering antibody against HFRS virus. Methods Repertoires of human ScFv and VH displayed on pHEN1 have been generated directly from human PBL. The two repert

4、oires were panned into grade-4 repertoires. The activity of each clone to bind HTV was examined by using ELISA.Results 14positive ScFv clones and 11 positive VH clones have been found . The highest value of A410 in positive ScFv clones was 0.44, and in positive VH clones was 0.50. The two clones wer

5、e sequenced, and the sequencing results demonstrated that the genes of ScFv and VH were the human antibody genes, and the gene ligating, cloning and screening were correct and successful. The secretory expression of ScFv and VH were also carried out.Conclusions The experimentalresults suggest that t

6、he skills used in the paper are good to obtain the genetic engineering antibedy against HFRS.And the antibody could be used for prevention and treatment of HFRS.【 Subject words 】 Phage antibody Hantavirus Single chain Fv Variable region of antibody有关汉坦病毒（ Hantavirus, HV ）的抗体曾有较多报道，但都为鼠源性抗 体或者非真正意义上的

7、基因工程抗体（即没有绕过杂交瘤和人工免疫技术而制 备的基因工程抗体）。这些抗体有许多众所周知的不足因而使它们在临床的应 用受到限制。噬菌体全套抗体库技术可以绕过杂交瘤和免疫技术而制备真正意 义上的人源性基因工程抗体，为基因工程抗体研究开避了广阔的前景。我们从本院收治的来自不同疫区的10例肾综合征出血热（HFR$病人的 外周血淋巴细胞（PBL提取RNA,以Oligod（T）15 为引物合成cDNA第一链， 以自行设计的数对人抗体 V区通用引物扩增出了人抗体 VH Vk、V入基因，以 自行设计的linker引物扩增了 linker, 并通过SOB反应（splicing by overlap ext

8、ension ）构建了单链抗体基因（ScFv）。以载体pHENI与ScFv、 VH重组，转化大肠杆菌菌株 TG1,经过M13KO7勺超感染，成功地构建了人源性 全套ScFv（VH -linker-V k ）和VH噬菌体表面呈现文库1。本文将就该两种文 库勺筛选、抗体活性鉴定、序列测定以及分泌型表达等方面作一报道。材料与方法1.PBL分离和处理、RNA提取、cDNA第一链合成、引物设计、PCF方法、SOE反应、M13KO超感染以及文库的获得：均参见文献1。2.文库的 panning 筛选：以 Chen R22 76-118、Seoul 等 4 株 HV （鼠脑 浸出物）混合物对倍稀释后包被 90

9、mn聚苯乙烯平皿，将文库倾至平皿上（10ml/皿），37C置3小时，弃液体，以 PBS-0.05%Tween 20洗皿20次。以 来自M9平板并经扩大培养的TG1菌液（10ml/皿）覆盖平皿，37C置2小时, 收液体，37C摇床培养1小时，离心后沉淀以2X YTAG含100卩g/ml氨苄青 霉素、2%葡萄糖的2X YT）10ml重悬，37C摇床培养过夜。给过夜培养物中加入 4X 1010PFU的M13KO7 37C摇床1小时，离心弃上清。沉淀以 2X YTAK含氨苄 青霉素、卡那霉素各100卩g/ml的2X YT）重悬，37C摇床培养过夜，4C、 4000r/min 离心 10分钟，收集上清即

10、为次级文库。上述包被、吸附、洗脱、再 感染、扩大培养（扩增）、超感染、获次级库的全过程称之为panning。本研究做了 3 轮 panning 至获得四级文库。3 .单克隆化及克隆抗体活性鉴定：单克隆化以SOBAG含 100卩g/ml氨苄 青霉素、2%葡萄糖的SOB）平板铺板培养的方法进行，获得各克隆含重组pHEN1的上清。各克隆抗体抗HV活性鉴定以常规ELISA方法进行，其中包被抗原用 Chen R22 76-118、Seoul等4株病毒鼠脑浸出混合物。二抗用羊抗 M13抗体（Pharmacia出品），酶标抗体用驴抗羊-HRP（华美公司出品）。阴性对照孔 以0.5% BSA包被，阳性对照孔以

11、羊抗 M13抗体包被，底物为OPD（华美公司提 供），测A410值。4最高A410值克隆抗体基因序列测定参照Sambrook等所述制备单链测序模板2，按载体pHENI克隆位点双侧序列设计测序引物，送北京赛百盛（美 国）生物工程公司以双脱氧末端终止法在全自动测序仪进行测序。5分泌（可溶）型表达 ：将上述测序证实后的克隆重提重组子，转化大肠 杆菌HB2151菌株，在IPTG诱导下进行分泌型表达，分别从培养上清和细菌周 质中收获可溶性抗体片段。结果1 文库的panning筛选：ScFv文库和VH文库的库容以建库用PBL衡量均 为106 PBL，以建库后其噬斑形成单位（PFU衡量均约为5.5 X101

12、2PFU2。经 过3轮panning筛选，获得四级文库，ScFv四级文库和VH四级文库库容分别 约为 2.5 X 1012 PFU 和 3.5 X 1012PFU2 .单个克隆化及各克隆抗体活性鉴定结果：四级文库菌种经100 ：1和 1000 ：1稀释后在SOBA琼脂板上铺板培养，共收集了 180个ScFv菌落和200 个VH菌落。经扩大培养及M13KO超感染，获得了 380个克隆的含融合表达产 物的重组子的上清。以4株HTV混合物包被96孔板，以抗M13抗体为二抗，以 驴抗羊-HRP为酶标抗体，做常规ELISA检测。结果获得14个ScFv阳性克隆和 11个VH阳性克隆，A410值见表1和表2

13、。最高A410值克隆分别是BS22 （0.44） 和 AV7（0.50） 。表1 ScFv融合表达阳性克隆ELISA检测结果Table 1. Result of ELISA examining for positive clones of ScFvNumbersofAS4BS12BS22CS4CS10positiveclonesValue ofA4100.360.340.440.400.29CS120.33表2 VH融合表达阳性克隆ELISA检测结果Table 2. Result of ELISA examining for positive clones of VHNumbers of po

14、sitive clonesAV2AV7AV8AV9AV12CV8DV12EV3GV0.410.500.400.420.390.340.330.310.49Value ofA4103 最高A410值阳性克隆测序分析：两次小量制备单链测序模板每种约10卩g o ScFv (700750bp)测序用长胶，VH(300370bp)测序用短胶。测序结 果如图1、2。将序列测定结果推导成多肽链序列，则如图3,图4。图1 ScFv-BS22序列测定结果Fig 1. The seque ncing result of ScFv-BS22 cloneThe seque nee before lin ker is

15、 VH, the one after lin ker is Vk图2 VH-AV7序列测定结果Fig 2. The seque ncing result of VH-AV7 clone图 3 ScFv-BS22 多肽链序列推译Fig 3. The inference of polypeptide sequence for ScFv-BS22The sequence before linker is VH, the one after linker is V图4 VH-AV7多肽链序列推译Fig 4. The inference of polypeptide sequence for VH-AV

16、7以上DNA序列经与gene-bank中抗体基因家族以及文献资料比较分析，发 现各FR区均符合人抗体相应FR区特征，提示均为人抗体基因，证明基因的拼 接、克隆、筛选均获成功。4 .抗体片段的分泌型表达（可溶性表达）：将ScFv-BS22和VH-AV7克隆的宿主菌由TG1更换为HB2151后，在IPTG诱导下进行分泌型表达。来自培养 上清和细菌周质的可溶性表达产物均经三蒸水透析 48 小时。聚丙烯酰胺凝胶电 泳测定ScFv-BS22和VH-AV7可溶性表达产物相对分子质量分别约为 31 X 103和 15X 103，与预期相符。讨论噬菌体抗体库技术属于目前分子生物学和分子免疫学的新技术，该技术的

17、 主要优点有：大大提高了抗体基因文库的筛选效率；绕过了杂交瘤和免疫 技术而制备抗体；模拟了天然抗体库 5。本研究直接从人PBL构建了人源性全套ScFv（VH-linker-V k ）和VH噬菌体 表面呈现文库，由于使用了通用引物，采血对象是来自不同疫区的特异性 IgG 阳性的HFRS恢复期患者、构建ScFv时基因可再自由配对，所以，对于筛选抗 HV抗体来说，该库库容（106 PBL）已足够大。文献一般对所建文库 panning 两次至三级文库用作克隆筛选，我们为了随 后克隆筛选的便利，对两个文库 panning 了 3次，获得四级文库，文库中目的 重组子克隆所占比重（相对）已足够大。共筛出了

18、14个ScFv和11个VH抗HTW日性克隆，其中ScFv-BS22和VH-AV7是各自阳性克隆群中活性较高者（为了下一步表达产物活性较高并最终获 得活性较高抗体，这里特选 A410值最高者），其序列经与genebank中人抗体 基因家族成员以及文献资料3,4比较分析，发现各片段FR区均符合人抗体各相 应FR区特征。随后进行的分泌型表达产物的分子量的测定也与预期分子量相 符。以上结果提示所获基因片段均为人抗体基因片段，表明基因的拼接、克 隆、筛选是成功的。ScFv和VH片段均无Fc区，故以M13抗体对融合表达产物进行 ELISA检 测，因此种表达产物是抗体片段与噬菌体外壳蛋白( CPH)的融合表

19、达产物。 这种检测方法有一定误差，由于国内实验条件所限，目前尚无更好的方法。 0.44 和 0.50 这样水平的活性指标，显然不够理想，有待于以分子生物学方法 (如点突变法等)进一步提高其活性。在汉坦病毒(HV)抗体方面，以往的研究尚未脱离杂交瘤技术。采用噬菌体 抗体库技术直接从人体克隆人源性抗 HV的基因工程抗体，获得了有一定 HV结 合活性的ScFv(VH -linker-V k )和VH 2种抗体片段，进一步对表达产物特性 进行研究对HFRS的防治将有一定的理论及实际价值。本课题受两项国家自然科学基金( 39370619， 39400117)资助参考文献1 侯颖春，白雪帆，杨为松，等 . 出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的 构建.细胞与分子免疫学杂志，1997