(完整版)琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

1、琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量 较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电 泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差 100bp 的 dna 片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝 胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段 dna。普通琼脂糖凝 胶分离 dna 的范围为 0.2-20kb ，利用脉冲电泳，可分离高达 107bp 的 dna 片段。操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意 dna 酶污染的仪器可能会降解 dna ，造成条带信号弱、模糊甚至缺失 的现象。选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，

2、 特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的 巨大 dna 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的 dna 链用普通电泳可能跑不 出胶孔导致缺带。正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.5 2之间，低浓度的用来进行大片 段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用 质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 dna 带不 易分辨，造成条带缺失现象。适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有 tae 和 tbe，而 tbe 比 tae 有着更好的缓冲能力。电泳 时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后

3、，离子 强度降低，ph 值上升，缓冲性能下降，可能使 dna 电泳产生条带模糊和不规 则的 dna 带迁移的现象。电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过 20v/cm ，电泳温度应该低于 30，对于巨大的 dna 电泳，温度应该低于 15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的 dna 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶 而出现缺带现象dna 样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 dna 样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙 醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的 d

4、na 样品可能导致 条带模糊和缺失，也可能出现不规则的 dna 条带迁移。在上样前不要对 dna 样品加热，用 20mm nacl 缓冲液稀释可以防止 dna 变性。dna 的上样正确的 dna 上样量是条带清晰的保证。注意太多的 dna 上样量可能导致 dna 带型模糊，而太小的 dna 上样量则导致带信号弱甚至缺失。tiangen 公 司 dna 分子量标准每次上样 6ul 即可得到清晰均匀的条带。marker 的选择dna 电泳一定要使用 dna marker 或已知大小的正对照 dna 来估计 dna 片段大小。marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标

5、片 段大小的估计才比较准确。tiangen 公司的 dna marker 条带清晰，亮度均匀， 质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是 marker 的电泳同样也要符合 dna 电泳的操作标准。如果选择 dna/hindiii 或者 dna/ecori 的酶切 marker，需 要预先 65 加热 5min，冰上冷却后使用。从而避免 hindiii 或 ecori 酶切造成 的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。凝胶的染色和观察实验室常用的 核酸染色剂是溴化乙啶（ eb），染色效果好，操作方便，但 是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如 sybr green，gelred，虽然毒性小

6、， 但价格昂贵。tiangen 公司的 genegreen 相比则是性价比高的低毒替代染料， 其灵敏度比传统 eb 染料高 10 倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合 适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现 象。步骤如下：1. 制备 1%琼脂糖凝胶(大胶用 70ml, 小胶用 50ml): 称取 0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于 锥形瓶中,加入 70 ml(50ml)1 tae, 瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸 3 次至琼脂 糖全部融化,摇匀,即成 1.0% 琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备 : 取电泳槽内的有机玻璃内槽 ( 制胶槽 ) 洗干净 , 晾干 ,

7、 放入制胶玻璃板 . 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 , 形成模子 . 将内槽置于水平位置 , 并在 固定位置放好梳子.将冷却到 65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃 板上 , 使胶液缓慢展开 , 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 .室温下静置直至凝胶 完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1tae 电泳缓冲液至没过胶板 1-2 为止.3. 加样:在点样板或 parafilm 上混合 dna 样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终 稀释倍数应不小于 1x.用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品 , 应更换一个加样头 , 以防污染 , 加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶 面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳 : 加样后的凝胶板立即通电进行电泳 , 电压 60-100v, 样品由负极 ( 黑色 ) 向 正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 .当溴酚蓝 移动到 距离胶板下沿约 1cm 处时,停止电