Taqman技术不使用内对照系统只能作为一种定性的测定

1、Taqman技术不使用内对照系统只能作为一种走定性的测定上海皓源生物科技有限公司黄道培Taqman是一种PCR的衍生技术，由Rode Molecular System lnc.（罗氏公司）发明，并在西方发达国家注有 专利。该系统一直用于研究单位，没有得到FDA的批准，在国际上不能用于临床检测。但它具有操作简便，自动化程度高，较易防止污染等特征。它对样品的测定主要使用CT值（临界循环数值）,阳性样品在CT（临界循环）后信号以对数升高，而阴性样品仍保持在低水平。现将Taqman和常规PCR（Amplicor）之间的比较，列于表1。表1 PCR ELISA与荧光法（Taqman）比较PCR ELIS

2、ATaqma n原理PCR常规技术（TaqmanPCR衍生技术（Taqman特异性好好灵敏度103病毒单位/ml以CT值表示，无内对照，不能用于定量内对照系 统有无准确性以相对值表示可分辩度相差 一倍的样品以CT值表示，无内对照，不能用于定量循环数32到36循环，PCF线性范围 内样品稀释法可使高浓度血 清PCR放大仍在线性范围内40循环，不定期到了 PCF平台区。 使用临界循环值CT来“计量”。Taq酶作用耐热DNA聚合酶5 -3 外切酶活力难测定造成计量 困难引物和探 针分开，测定时互干扰引物和探针必须“同时”形成杂交 链才会有信号仪器临检实验室常规仪器PCF仪、 酶标仪、投资少。或全自动

3、仪COBAS-TPE5700单波长，不能用于定量；PE 7700双波长、 lightcycler（Roche）3波长、Icycler（Biorad）4波长、加入内对照系统后可用于定量。操纵方式样品制备简单，可保证HBV病 毒不丢失检测步骤较多检测较简便，样品制备需离心，不 能确保100%勺回收。防污染加入UN柯防103-104个扩增 产物分子的污染除扩增产物污染外，样品中蛋白质 等也可能引起荧光污染，需有专用 手套、反应管等，样品中不能含蛋 白质。发展方向与未来的发展基因芯片能兼 容自成一体，受限于荧光标记物和仪 器的波长，不可能与基因芯片等技 术兼容FDAtt准情 况批准未申报临床使用自93

4、年至今（Amplicor）未用临床临测情况获 SDAB准HVBQ定量）（浩源）TB （定性）（华美）（宏锦）HBV定性（达安、匹基）HCV定性（达安、匹基）Taqman作为自动化程度很高的一种方法，具有其应用价值，但根据PCR方法的原理和临床实践。使用 Taqman作定量PCR时必需具备内对照系统。这是我国专家们的一致意见。SDA也没有对缺少内对照系统的Taqman试剂发给 定量的新药证书。内对照系统可校正PCR效率而获得定量结果，它是国际上公认的科学方法。 当PCR的循环数为34时, 常规的（或称终点法）PCR产物数量和PCR平均效率有密切的关系。目前国内所使用的Taqman和常规法之间的不

5、同是前者用即时法，使用CT值来代表样品的浓度。而后者用终点法在PCR完成后测出全部的 PCR产物量，再确定原样品浓度。简单地说,Taqman对PCR平均效率 的敏感区，由 34循环减少到了 20到24循环，这时PCR平均效率的影响，要比终点法稍小一点（见表2A）,即若 平均效率为0%时,从相差7倍减少到相差3倍。表2 PCR平均效率与放大倍数的关系（1+X）n=（ AF）公式X效率n循环次数AF放大倍数100%201. 1E+1(f90%203.8E+10585%202.2E+1080%201.3E+10575%207.3E+10470%2044.1E+1065%202.2E+10460%20

6、1.2E+104100%341.7E+101090%343.0E+10985%341.2E+10980%344.8E+10875%3481.8E+1070%346.8E+10765%342.5E+10760%348.7E+106100%401.1E+1290%401.41E+1185%404.86E+10:80%401.63E+1075%405.27E+0970%401.65E+0965%405E+0860%401.46E+08目前在我国常规PCR法使用34循环Taqman临界循环数CT20循环在不使用 内对照系统时，让我们来看一下Taqman PCR平均效率对CT的影响。 为了更直观地了解

7、X（PCR平均效率）对CT值的影响，我们用下图作表示。（见图）TC2021222324252627one9084 :7874I?。167r 61two858075716761three75716660four70666361那么为什么X（PCR平均效率）会有变化，从临床检验来讲，最大的问题是加入到 PCR反应中的样品不纯。 尤其是血样，其溶血程度不一，很易对Taq酶（PCR反应所赖以进行的关键试剂）造成不同程度的抑制作用而使 X下降。不同的血样也确实很易造成X有10%的偏差，而反映到CT时就可相差2-3个循环，从外标准曲线来看，就会相差五到十倍（见表2B）。因此，Taqman法如果不加入内对照

8、系统只能作为定性来使用。表2B为什么不能用外标准曲线进行 PCR定量主要原因是因为PCR样品较杂，各病人血样所含对 PCR的抑制物不同，因此各血样的PCR反应的平均 效率很不一致，这样就必须要校正 PCR的平均效率后才能作定量比较。下面以一个实例来表示 当PCR进行34个循环，n=34时血样原始浓度（拷贝/毫 升）拷贝用量（C）（PCR使 用1微升血清）PCP平 均效率（X）扩增后总拷贝数（CX AF）从外标准曲 线求出原始 相对浓度（%甲55X 1025X 1070%103.4 X 10100(AF=3.4 X 1010)乙1X 1051X 10280%4. 8X 1010141(AF=4.

9、 8X1010)从上例中可看出，乙号血样由于抑制物稍少，PCR平均效率高10%,结果放大后产物量比甲号血样多。如以外标准曲线来求原始浓度，乙反而比甲高岀1.41倍,这样就会作岀错误的判断。如果使用内参照将平均效率求出，再校正扩增倍数，使甲、乙血清放大倍数一致，就可取得甲比乙高出约 5倍的正确结果了。同样,若使用Taqman方法。由于效率不一致，乙在外标准曲线上查到的浓度反而会高出3倍，造成定量的错误。血样原始浓度(拷贝/毫 升)拷贝用量1 卩 1(C)PCP平 均效率1-20循环cm从外标准曲线求 出原始相对浓度(%甲5X 1055X 10270%25 丁100乙1X 1051X 10280%22300编者按 聚合酶链反应(PCR)作功一种基因分析技术有着非营广泛的临床应用前景。以诊断或监测为目的