BCA蛋白浓度测定试剂盒完整版

1、BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明23225蛋白质化验试剂盒：为5 00试管或500 0微孔板得检测提供充足得试剂 23227蛋白质化验试剂盒：为2 50试管或2 5 0 0微孔板得检测提供充足得试剂 试剂盒组分：BCA 试剂 A,10 0 0 mL （No、2322 5 产品中） 或 50 0mL （ N o、 23 2 27 产品中 ）, 碳酸钠，碳酸氢钠，二喹啉甲酸，酒石酸钠溶于0、1 M氢氧化钠中。BC A 试剂E ,25 mL, 包括4%硫酸铜一次性标准白蛋白，2mg/ mL ,10 X 1 mL 安瓿， 包含2 m g/ mL牛血清白蛋白（ BSA ） 存在于 0、 9% 盐与0、 0

2、5%叠氮化钠 中。储存 ：以上试剂保持在室温下储存与装运注意：如果试剂 A 或 试剂 B 在低温下运输或长期储存时出现沉淀现象,可以通过缓慢加温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时请丢球试剂盒。目录介绍 、1准备标准试剂与工作试剂 、2准备试管 、3准备微型版 、3故障检修 、4有关美国热电其她产品 、5附加信息 、5参考文献 、6介绍美国热电（T hermo）公司得BCA蛋白浓度测定试剂盒 就是基于二喹啉甲酸（BCA ）通过比 色检测与定量测定总蛋白得洗涤剂兼容配方。 该方法通过碱性介质中得一种蛋白结合了 Cu2使其显著减少转变为 C u 1 （缩二脲反应）。用一种含二奎

3、琳甲酸得试剂选择性得比色法高敏 感得比色杯中得 Cu 1、这种测定方法得紫色色反应产物就是通过BCA得两个分子与亚铜离子螯合作用形成得。这种水溶性复合物在 562nm 处有强吸收峰。在大得活性范围内（2 0-20 0 0g / mL ）几乎同蛋白浓度增加呈线性关系ECA法不就是真正得终点得方法 ；也就就是说 ,最终颜色继续发展。孵化之后，继续得颜色发展速度就是足够慢以允许一起进行测定大量样本。大分子结构得蛋白质，肽键得数量与存在得四个特定氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸,色氨酸与酪氨酸）据说就是与BC A形成颜色产物得原因.因此，蛋白浓度得测量通常要参照标准得一个常见得蛋白质如牛血清白蛋白.一系列已知

4、浓度得蛋白质稀释液就是为与之相近得未知蛋白质浓度测定准备得 因为每一个未知浓度得测定都需要基于标准曲线。 如果需要将一个未 知蛋白精确定量 ，选择一个与未知蛋白特性相似得标准蛋白就是可取得。例如 ，当测定免疫球 蛋白时牛血清丙种球蛋白可以被当做标准蛋白.以下给出了两种检测过程 ：其中 ，试管程序需要一个较大得体积（0、1毫升）得蛋白质样品。然而，因为它使用了一个样品比例为1:20得工作试剂（v / v）,所以将干扰物质得影响降到最小。在酶处理 程序提供了一样品处理酶 ，需要体积较小（1 0 -25丄）得蛋白质样品。然而，由于使用了样 品比例为1:8得工作试剂（v / v），所以在克服干扰物质浓

5、度时灵活性降低，从而获得得检测水平较低 .标准试剂与工作试剂得准备（试验程序需要得两个）A. 雅备稀释得 BS A标准液表1为导向，准备一套蛋白质标准。稀释标准得内容为，将一个盛在安瓿管中得标准 BSA稀释 到几个洁净得瓶子中，最好使用与样本（s）相同量得稀释剂。根据表1得建议：每1毫升得 安 瓿管中加入2毫克/毫升得BSA标准液对于准备一系列得标准稀释液就是足够得。每个稀释标准重复三次也就是足够量得。表一:准备稀释得BS A标准液标准试管协议与微型版程序得稀释方案（活性范围=20 2 0 00用/ mL ）AvV 口吕号稀释液体积（卩L）BS A来源及体积（卩L）BSA终浓度（吐/ mL ）

6、A03 00得原液2 0 00B125375得原液1 500C3 2 532 5得原液1000D1 7 5175得E管稀释液7 5 0E3 25325得C管稀释液5 0 0F3 25325得E管稀释液2 50G32 532 5得F管稀释液125H40010 0得G管稀释液25I4 0000 =空白加强试管协议得稀释方案（活性范围=5250 %/ m L）AvV 口吕号稀释液体积（1L）B SA来源及体积（LB SA终浓度（1L /mL ）A7 001 00得原液250B4004 00得A管稀释液12 5C45 03 0 0得B管稀释液50D4 004 0 0得C管稀释液2 5E400100得D

7、管稀释液5F40 000=空白B:准备BC A得工作试剂（WR1、总共需要得W R得体积可以通过以下公式计算出来：（标准液+未知液）x （平行数目）X （每个样品中加入得 WR体积）= 总共所需得 WR体积 例如：标准得试管程序有三个未知液，每个样品做两组重复：（标准液9mL+未知液3 mL ）x（平行数目2） x （2 m L ）=总共所需得 WR体积4 8 m L 注意:试管程序中每个样品管加2、0m l WR微型版程序中每个样品中只需要加2 00ul W R2、W R得制备：（BC A 试剂A : B=50:1 ），对上述样品，将50 mL试剂 A与1 mL试剂B混 合。注意：当试剂B加

8、入到试剂A得开始，浊度观察表明：混合后迅速消失变成澄清得绿色得 WR. 准备充足得W R就是基于所测样品数量上得。如果将 WR储存在处于室温（R T ）得密闭容器 中，那么几天之内WR就是稳定得。简要步骤（试管程序,标准方案）试管程序（样品:WR = 1 ：20）1、 用移液管移取每个标准品与所测样品得重复O、lm I到有标签得对应试管中。2、 ？在每个管中加2、0m 1得 WR，混匀。3、？封口，然后温育试管（选择时间与温度）1 ）标准方案：37 C 3 0m i n （wo r king ra n ge=2 0 -2000u g / m I）2）RT 方案：R T 2 h （w o rk

9、i n g ran ge =20 2 000ug/ ml ）3）En h an c ed Prot oc o 1 （加强方案）：6 0 C 30m in （wo rki n g r a nge = 5-2 5 0ug / m 1 ）注意:每个实验中都增加培育时间与温度，增加5 6 2 n m得净吸光度，降低试剂得最低检测水平与方案得工作范围；使用水浴加热管要么就是标准 （3 7 C培养）或就是增强（60 C 培养）协议。使用强制得 培养可能会因为热传递不均匀使其在颜色变化上引进明显得误差4、使所有管子冷却至室温5、分光光度计设定在 5 6 2n m，当比色皿中装得就是水时给仪器校零。随后，确保

10、在10min内测完所有样品得吸光度。注意：因为BC A测定不就是真正得终点，即使冷却到室温颜色还会继续变化。然而，由于在室温下颜色变化速度比较慢，所以如果在10mi n内测完所有试管得吸光度就不会引进明显得误差。6、 所有得单个标准品与所测得样品重复在5 6 2nm测得得吸光度都要减去在562n m测得得所有空白标准品得吸光度平均值。微型板程序（样品：WR =1 : 8）1、用移液管移取25ul得WR到每一个标准品与未知样品所在得微型板中（w o r k i n g r ange=2 0 2 OOOu g/ m 1）注意:如果样品大小被限制为：每个未知样品与标准品只能使用 10ul（sampl

11、e t o WR rat i o=1: 2 0 ）、然而,被测量得w ork ing ra nge在这种情况下将被限制为 125 200 0 ug /m lo2、每个孔中加20 0 ul得WR，用pl at e shak e r混30 s,使其彻底混匀3、？封口 ,温育 37 C 30 mi n4、冷却到室温5、用酶标仪测量在5 6 2 nm或接近5 6 2 n m得读数注意：1）这种方法中波长在 540-590 n m得范围内都能被成功得测量2 ）因为读板器使用得光线长度比分光光度计得比色皿要短，所以微型板程序需要使用样品比例比较大得工作试剂去获得与标准试管程序相同得灵敏度如果需要高于5 6

12、 2nm得测量，要将培养时间增加到2h、3 ）增加培养时间或样品工作试剂得体积比率，增加每个w ell在562nm得净测量值，降低实际得最低测量水平与测量得wor k ing ra nge。只要每个标准样与未知样都被同等对待，这样得修改也就是有益得.6、 所有得单个标准品与所测得样品重复在562 n m测得得吸光度都要减去在56 2 nm测得得所有空白标准品得吸光度平均值7、 准备一个标准曲线通过绘制每一个标准ES A在562nm测量得相对于空白对照得吸光度 平均值它u g/ml得浓度。使用标曲去测量每一个未知样品得蛋白质浓度注意:如果联系微型板读数器使用拟合得曲线算法，一个有四个参数得或最合

13、适得曲线将提 供比纯线性状态更精确得结果。如果用手绘制这个结果，一个点-分曲线将比线性更加适合标准点。故障检修问题可能原因解决方案在任何管中都无颜色样品包含铜螯合剂透析，脱盐，或稀释样品。增加工作试剂中铜浓度（例如,使用,试剂A: B 50: 2）使用得产品23215从样品去除干扰物质空白吸收就是可以得，但 就是标准与样本比预期得显示更少颜色强酸性或碱性缓冲 液改变了工作试剂得pH透析，脱盐，或稀释样品。颜色在错误波长下 被测量确定在56 2 nm波长下测吸光度样品得颜色比预期得深蛋白浓度太高稀释样品样品包含脂质或脂蛋白添加以减少脂质干扰使用得产品23 215从样品去除干扰物质所有试管（包括空

14、白）都就 是暗紫色缓冲液中含有还原 剂透析或稀释样品。使用得产品23 2 15从样品去除干扰物质缓冲液中含有巯基缓冲含有生物胺（儿茶酚胺）需要在不同波长下测量 颜色分光光度计或酶标 仪没有5 62 n m从5 4 0nm到590n m颜色可以在任何波长 下被测量，虽然标准曲线得斜率与整体测滤光器量得灵敏度将减少A：干扰物质某些物质干扰 BCA检测就是已知得，包括潜在得还原剂，螯合剂，强酸或强碱。因为她们可以干扰估算蛋白质每分钟浓度，作为样品缓冲液得组份应避免下列物质：抗坏血酸E G TA铁不纯得蔗糖儿茶酚胺不纯得甘油脂质色氨酸肌酸酐过氧化氢蜜二糖酪氨酸半胱氨酸酰肼类苯酚磺酞尿酸其她物质对BCA

15、法检测蛋白量有较少程度得干扰.并且这些在原来得样本中低于一定浓度只有很小得影响（可以容忍）许多物质得最大兼容得浓度在标准测试管协议中被列出。表2（见说明得最后一页）。物质就是兼容与标准测试管协议中指定得浓度，如果蛋白浓度得估计得误差就是由物质得存在所造成将会小于或等于10 %。在每一个实验之前，这些物质都会用现配得 WR进行测试空白校正得宰5 6 2 nm得吸光度测量值（1000/ m L白蛋白标准 品+物质）将会同0、9%生理盐水中精确配制得标准品在562n m出得净吸光度进行比较。样品:WR为1 : 8（v/v）得微孔板过程中最大兼容浓度将比较低。B、消除或减少干扰物质影响得，策略BCA蛋

16、白含量测定中干扰物得影响可以用以下几个方法消除或克服。通过透析或凝胶过滤去除干扰物质。稀释样品，直到不再有干扰。这种策略只在起始蛋白质浓度足够多余稀释后仍在检测活性范围之内就是有效得用丙酮酸或三氯乙酸（T C A）沉淀样品中蛋白质。 液体包含干扰物质将被丢弃，蛋白沉淀很容易在超纯水中溶解或直接用碱性BCA W R溶解。这一方案得详细流程可从我们网站获得另外，232 1 5号产品将被使用 （见相关Pierce产品）。适当得增加WR中铜得量（准备 WR试剂A: E为 50: 2 或5 0 : 3、）,这将减少铜螯合剂得干扰注意：为了最大限度得精确度，蛋白质标准品必须与样品（s）同样处理。有关美国热

17、电其她产品1 5 04196 孔板1 0 0/ pk g150 7 5 试剂水库 200 / p k g、1503696孔板密封带 1 0 0 /p kg、23 2 09 标准白蛋白安瓿 2mg/ mL 10 x 1毫升安瓿，包含牛血清白蛋白23 2 08 预稀释得蛋白质检测标准品：牛血清白蛋白集合,7 X、5 m L23212牛伽玛球蛋白标准品 2 m g/mL , 10 X1 mL安瓿2 3 2 35 微型BC A蛋白检测试剂盒工作范围为0、5 2 0/ m L23 2 36考马斯亮蓝检测试剂盒，工作范围得1 - 1 5 00呃/mL2 321 5 p a t Able ? 蛋白检测试剂组2 3 25 0 BC A蛋白检测试剂盒-兼容还原剂附加信息A。请访问我们得网站了解更多得信息，包括下列事项：常见问答技术指导：消除样品中干扰物质对蛋白质检测得影响B 、替代总蛋白检测试剂如果不能克服样品中还原物或金属螯合物得干扰。由一个减少物质或 met a l c helat in g物质包含在，试试美国热电公司得23236号考马斯亮蓝检测试剂盒，它对这些物质较不敏 感。C、玻璃器皿得清洁与重利用 小心谨慎使用玻璃器皿 .所有得玻璃器皿必须清洗与最后得超纯水冲洗。D、不同得蛋白质得反应特征 常用得总蛋白含量测定方法某种程度