毕业论文茯砖茶中菠甾醇的分离与鉴定

1、茯砖茶中菠甾醇的分离与鉴定作者：张 XX 指导教师：凌 XX （安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥， 230036） 摘要 ：茯砖茶为黑茶的一种，主要产于湖南，该茶在长期的应用实践中被证明具 有降血脂等保健作用。目前茯砖茶成分的研究尚不透彻，为了阐明其保健功能的 化学基础，我们首先利用有机溶剂提取，依据相似相溶的原理，利用各种溶剂的 极性的差别，依次萃取，使得原提取物中的不同的极性部分，分配到相应的溶剂 中，再用吸附层析法对这些部分进行分离处理，通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、 反相柱分离等方法，使待分离的化合物在此操作方法下的各个馏分尽可能的纯净， 利用现代天然产物的鉴定方法，确定所分离出的物质

2、的结构，最后得到一种白色 针状结晶物质。通过核磁共振碳谱、氢谱分析，可确定化合物为菠甾醇，该成分 曾在岩筋菜中发现 1 。关键词 ：茯砖茶 柱层析 核磁共振 菠甾醇 保健功能/、八1 前言1.1 黑茶1.1.1 黑茶的制作工艺与特点 黑茶是我国六大茶类之一，主要包括普洱茶、茯砖茶、六堡茶。黑茶初加工包 括杀青、揉捻、渥堆、干燥四道工序，相对于绿茶来说渥堆是黑茶初制独有的工 序，也是黑毛茶色、香、味品质形成的关键工序，而高温汽蒸和压造成型是黑茶 加工的共同特点 2 。由于特殊的加工工艺，使黑茶香味醇和不涩，汤色橙黄不绿， 叶底黄褐不青，其品质风味既不同于绿茶，亦有别于黄茶，形成独具一格的品质 特

3、征；绿茶的制作工艺一般为：鲜叶、杀青、初揉、初炒、复炒、提毫、烘干， 绿茶要求鲜叶为一芽二三叶或嫩芽而黑茶用的鲜叶原料较为粗老，多为立夏前后 采摘的 1芽 4、5叶新梢3 。1.1.2 茯砖茶和普洱茶的制作工艺及其特点茯砖茶和普洱茶都属于紧压黑茶，茯砖茶多以黑毛茶或粗老绿茶为原料经汽 蒸、沤堆、压制、发花、干燥等工序加工而成，其中发花是茯砖茶制造的独特工 序，其目的是通过控制一定的温、湿度条件，促使微生物优势菌的生长进而产生 黄色闭囊壳（俗称“金花” ），“金花”是茯砖茶的主要品质特征 4 。普洱茶是以晒 青绿毛茶为原料，经发水、渥堆和陈化及干燥工序加工而成，其中渥堆工艺对普 洱茶品质的形成至

4、关重要。1.1.3 普洱茶和茯砖茶中的主要化学成分及其功能研究进展到目前为止，国内外对普洱茶中成分的研究很少，周志宏、林智等从不同产 地的普洱茶中分离鉴定出的化合物共有 22种，其中只有四种相同，即：简单儿茶 素（表儿茶素、儿茶素、没食子儿茶素） 、简单酚性化合物（山奈酚、槲皮素） 、 黄酮类化合物（杨梅素）和黄酮类配糖体（山奈酚 -3-0- B -D-葡萄糖甙）。 其中没食子酸含量最高（ 9.01mg/g ） ，没食子酸，即 3，4，5-三羟基苯甲酸，有显 著的抗氧化活性，并有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等生理活性，是普洱茶的一 个最具生理活性的简单酚类化合物 8 9 。另外，普洱茶还具有抗脂

5、质过氧化、预防 高脂血症、减少心脑血管疾病发生等作用，在健齿、消除口臭、抑菌、减肥方面 也有保健功能。茯砖茶（产地湖南）中主要含有儿茶素（表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿 茶素没食子酸酯）、黄酮类糖苷（三羟黄酮醇 -芸香糖苷、栎皮酮醇 -己糖-鼠李糖- 鼠李糖苷、杨梅酮醇 -己糖-鼠李糖-鼠李糖苷、杨梅酮醇 -己糖-己糖-鼠李糖苷） 、 茶多酚（儿茶素没食子酸酯） 、咖啡碱等次生代谢物质，其中没食子酸和表儿茶素 没食子酸酯有减肥降脂的功效，茯砖茶还具有助消化、减肥、利尿、增强毛细血 管、养胃、健胃的作用 10 11 ，其中咖啡碱的刺激作用可以提高胃液的分泌量，从 而增进食欲、帮助消化，也可以刺激

6、膀胱协助利尿，利尿的同时还有助于醒酒， 解除酒精毒害作用；茯砖茶中含有 810%的茶多酚，长期饮用可增强毛细血管的 韧性，防止微血管的破裂。普洱茶和茯砖茶中的一些物质结构如下：没食子酸咖啡碱OHOHOHHOOH表儿茶素没食子酸酯SVOH O杨梅素OHOHOH(ECOH表儿茶素H HO、OHOH O山柰素OH槲皮素OHOH没食子儿茶素 山奈酚-3-O- B -D-葡萄糖甙HOOHOH表没食子儿茶素没食子酸酯本实验通过研究普洱茶和茯砖茶中的这些次生代谢物质，阐明其治病及保健 的化学物质基础。1.131生物碱结构特点及其功效茶叶中的生物碱含量为3%-5%主要有咖啡碱、可可碱和茶叶碱，他们均为黄 嘌呤

7、甲基的衍生物。含量较多的是咖啡碱，其合成的前体物质是可可碱，咖啡碱 易溶于水，在273nm处有最大吸收峰，也可以和大多数生物碱沉淀剂作用生成难容物。咖啡碱是一种常用药物，它有兴奋神经和利尿作用，对血管有扩张作用，对高 血压、低血压病有益，对防治胆固醇升高、动脉粥样硬化、心肌梗塞也有一定效果 12，结构如下：OMC NHHH3C NNHCCH3NNCH3黄嘌呤茶叶碱可可碱（2,6-二氧嘌呤）（1,3-二甲基黄嘌呤）（3,7-二甲基黄嘌呤）O虫讪iCH 30&N1.132茶多酚结构特点及其功效茶多酚（18%-36%是存在与茶叶中的多元酚的混合物，主要有儿茶素、黄 酮类、花青素和酚酸，其中儿茶素在茶

8、叶中的含量为12%-24%它是2-苯基苯并吡喃的衍生物；黄酮类的基本结构是 2-苯基色原酮13。儿茶素等具有帮助消化、 增加食欲、减少体内脂肪积累、降低胆固醇的作用，并有抑制痢疾、伤寒、霍乱、金黄色葡萄球菌等有害菌的作用，多酚类抗氧化剂还具有较强抗放射、 抗衰老、抗 血小板凝聚、抗动脉粥样硬化、降血压、抑癌作用14。结构如下：儿茶素花青素0H1.1.3.3糖苷结构特点茶叶中的糖苷是通过糖的端基碳连接而成的化合物，有a -苷和3 -苷两种,其结构如下:a -甲基-D-匍萄糖苷CJTgHB -甲基-D-匍萄糖苷1.134皂甙的结构及其功效皂甙，又名皂素、皂角甙或皂草甙，是一类结构比较复杂的糖苷类化

9、合物， 由糖链与三萜类、甾体或甾体生物碱通过碳氧键相连而构成，茶皂素是一类齐墩 果烷型五环三萜类皂甙的混合物，基本结构为皂甙元、糖体、有机酸三部分组成。 茶皂甙有吸湿性，味苦而辛辣，对咽喉粘膜有刺激作用，具有很强的起泡力和一定 的溶血作用，有多种生理活性，在药理方面有祛痰、消炎、镇痛止咳及抗菌等作用 对治疗多种类型的水肿有特效15 16。1.135 鞣质的结构特点及其功效鞣质又称鞣酸或单宁，是指存在植物界的一类结构比较复杂的多元酚化合 物。鞣质具有多种生物活性：如收敛作用、抗菌抗病毒作用、解毒作用、降压作 用、驱虫作用等17。1.2内含物提取、分离、鉴定的步骤与预实验原理欲研究茯砖茶中次生代谢

10、物的治病保健作用，需对这些有效成分进行提取、 分离和结构鉴定。主要步骤是预实验、系统分离、组分分离与精制、成分鉴定。 预实验的原理是：根据各成分极性的不同，先系统的分成几个不同的部分，然后 利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含 有的化合物类型，再根据相似相溶的原理，极性大的成分在极性溶剂中溶解度大, 极性小的成分则易溶于非极性溶剂。1.2.1 提取内含物的方法及原理溶剂法，根据相似相溶的原理提取内含物的方法；水蒸汽蒸馏法，内含物可以随水蒸汽蒸馏而不溶于水或微溶于水的原理进行分离；分馏法，利用沸点不同进行分离的方法；沉淀法，利用某些植物成分与某些溶剂产生沉淀的性

11、质而得到分离或除去杂质的方法；盐析法，是向提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或饱和，使一些成分在水中的溶解度降低，沉淀析出的方法；透析法，是利用小分 子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质而进行分离的方法。1.2.2 内含物的分离纯化，常用色谱法（层析法） 色谱法是利用不同的物质在固定相与流动相中不同的平衡分配系数来进行 的分离的一种方法，在色谱分离中，试样混合物在固定相和流动相之间连续不断 地进行分配以达到平衡，不同的化合物由于它们之间的理化性质的差异，在两相 中存在量也各不相同。常用方法如下：吸附柱层析法，常用的吸附剂是硅胶和大孔吸附树脂，硅胶可用于非极性化 合物也可用极性

12、化合物，如萜类、甾体、生物碱等，而大孔吸附树脂多用于皂苷、 生物碱、黄酮类化合物的分离 18 。凝胶过滤层析法，其原理是凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物 流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙 向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内 外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。常用的凝胶是交联 葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶是由天然高分子-葡聚糖与其他交联剂交联而成，常用的是sephadex系列，它是葡聚糖与3氯1,2环氧丙烷 相互交联而成，如sephadex LH 20,是Sepha

13、dexG 25的羧丙基衍生物，溶于水 和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。高效液相色谱法（HPLC,主要由进样器、分离柱、检测器、记录仪组成 19 o 常用反相色谱法（RPC，一般用非极性固定相（如C8、C8）,流动相为水或缓冲液。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物，如：茶多酚。气液色谱法，原理是各组分在固定液中溶解能力不同，溶解度大的较难挥发， 停留在柱中时间较长，前移较慢；溶解度小的前移较快。经一段时间后，各组分 彼此分离。另外除了以上介绍的方法外还有纸色谱法（pc）、薄层色谱法（tic ）、高速逆 流色谱等方法。1.2.3 次生代谢物质结构的鉴定（光谱鉴定法） ，常用的四大谱是紫外光

14、 谱（UV、红外光谱（IR）、核磁共振谱（NM）质谱（MS。核磁共振谱，其原理是原子核在磁场中吸收一定频率的无线电波而发生核自旋 能级跃迁的现象。在照射频率确定时，同种核因在分子中的化学环境不同而在不 同共振磁场强度下显示吸收峰的现象称为化学位移， 其表示方法以四甲基硅 （TMS） 为标准物质，规定它的化学位移为零，然后根据其他吸收峰与零点的相对距离来 确定他们的化学位移值。核磁共振谱仪由永久磁铁、射频振荡器、射频信号接收 器、样品管组成。常用的是氢核磁共振谱和碳核磁共振谱。紫外光谱，记录有机分子在吸收紫外光 （200-400nm） 后产生电子振动而形成的 吸收光谱，常用于研究不饱和有机物 ,

15、 特别是具有共轭体系的有机化合物；红外光 谱，记录有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的吸收光谱。质谱，质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的 一种分析方法 20 。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或 磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z、分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。一般，MS测定采用电子轰击法（electron impact ionization，简称 El、，故称 EI-MS，测定 EI-MS时，需要先将样品加热汽化，使之进入离子化室，而后才能电离，因此容易 发生分阶段的化合物或难于汽化的化合物，如醇、

16、糖苷等，往往测不到分子 的离子峰；而一些大分子物质，如糖的聚合物也难于汽化而无法测定；另外， ESI-MS也较为常用，是采用电喷雾，ESI为电离源。2 实验部分2.1 材料与方法2.1.1 主要仪器数显恒流泵，BT 100B型，上海青浦沪西仪器厂产品；旋转蒸发仪，CCA-1110 型，日本生产；电热板，DB-2型，国华产品；核磁共振仪， av400型，bruker公 司产品。2.1.2 内含物的分离纯化硅胶吸附色谱柱为实验室自装，玻璃柱（D6*100cm，填料选择安徽良臣硅源 材料有限公司生产的 200300目柱层层析硅胶，采取湿法装柱，洗脱液选择（三 氯甲烷）：（甲醇）=98: 2洗脱，用5

17、00ml试剂瓶收集洗脱液，正相板检测后，将目 标产物混合、浓缩即可；反相色谱柱选择 YM公司生产的50um球形反相硅胶。2.2 实验步骤2.2.1 样品的粗提取2.2.1.1 样品提取物的制备取1.8kg的茯砖茶经过粉碎后，置于玻璃制的提取罐中，以 70%丙酮冷浸，经 过两天的浸泡，将所得溶液合并放置旋转蒸发仪浓缩，加入适量水制成混悬液。2.2.1.2 有机溶剂萃取（ 1 ）石油醚萃取将混悬液放入分液漏斗中,用石油醚完成5次萃取，共得500mlX 5后进行浓 缩。（ 2）氯仿萃取将石油醚萃取后剩余的混悬液，继续用氯仿萃取 4 次，直到氯仿的颜色已经 很淡。（ 3）正丁醇萃取再将氯仿提取后的混悬

18、液继续用正丁醇萃取。222 条件实验，用反相板反复展开样品（石油醚萃取部分）10次，甲醇为展 开液，观察结果（图1），并记录（样品为凝胶柱层析液）。图1、石油醚萃取部分反相板展开结果2.2.3向装有样品的三角瓶（石油醚萃取部分）中加入少许氯仿溶解样品，用蒸 馏过的甲醇冲洗反相柱（约 200ml）,清洗两个三角瓶，试管若干，切好硅胶板若 干，配好展开液（氯仿：甲醇=100： 2）。2.2.4 进样，柱子冲过之后，将样品移入试管中，暂停恒流泵，迅速打开然后关 闭泵一次，使吸液管前有少许空气，吸入样品 1 2ml，大约40min后接第一份样, 以后每7min接一次。2.2.5蒸馏，将接好的样品转入蒸

19、馏瓶中，通过旋转蒸发仪将样品中的洗脱液甲 醇蒸干，甲醇回收；样品蒸干后用少许氯仿溶解，放入试管中，注意如果蒸馏瓶 中残存的有水分，加入少许丙酮处理。2.2.6点样，用氯仿将毛细管冲洗干净，吸入少许样品，轻轻的点在硅胶板上（两次，注：第一次干后再点第二次），将点好的硅胶板吹干，放入展缸中展开，展开 后再次吹干，向板上喷洒硫酸-乙醇混合液（注：此过程在通风橱中进行），后把硅 胶板放在100150 C的电热板上显色。2.2.7观察并记录结果（图2）图2、石油醚萃取部分反相柱分离结果结果：浓缩 2、3 份样，8 9 份样（csa11）, 10、11、12、13 份样（csa11+5）,14、15、16

20、 份样（csa13），其中 csa11、csa5 和 csa13 为目的样。继续分离csa11+5,过程同上，结果如下（图3）：图3、反相柱分离csa11+5的结果继续分离csa11+5，过程同上，结果如下（图4）：d I I I L L L 1I I I E L I I, 1图4、反相柱分离csa11+5的结果确保浓缩液中无其他物质，用反相板展开 10、11、13、15、17号样，反复展开8 次，甲醇为展开液，结果如下（图 5）:图5、反相板展开反相柱分离csa11+5的结果的结果浓缩8、9份样（csall）, 1318份样（csa5）, 11、12、19、20份样放入余液中2.2.8打谱，

21、将获得的目的样浓缩，烘干，称重，经核磁共振打出氢谱。谱图为 附件1、附件2。2.2.9纯度鉴定，通过对氢谱观察，没有干扰峰出现得出分离物没有杂质，纯度 好。2.2.10打碳谱，谱图为附件3和附件43结果与分析3.1结果菠甾醇的13 C-NMR化学位移（100Mhz ppm）位置化学位移位置化学位移137.2 (CH)1523.1(CH2)231.9 (CH)1628.5(CH2)371.1 (CH1756.0(CH)438.0 (CH)1812.1(CHa)540.3 (CH1913.1(CHa)629.7 (CH)2040.8(CH)7117.5 (CH2121.1(CHa)8139.6 (

22、C)22138.2(CH)949.5 (CH23129.5(CH)1034.3 (C)2451.3 (CH1121.4 (CH)2531.5 (CH1239.5 (CH )2619.0 (CH)1343.3 (C)2721.6 (CH )1455.2 (CH2825.4 (CH )2912.3 (CH)3.2目标分离物的表征分离目标产物csa11为白色针状结晶，其分子结构如图6所示3.3讨论3.3.1本试验成功的在茯砖茶中分离出菠甾醇，但是后来没有做此单体化合物的 抑菌试验，有些遗憾。菠甾醇曾在瓜蒌皮和岩筋菜中发现21。3.3.2由于我不懂解核磁共振氢谱和碳谱，最后的结构是由凌老师帮忙解出的，

23、 所以在这一方面还是有待提高和研究。4致谢本论文在安徽农业大学茶与食品科技学院凌 XX老师的悉心指导下和实验室凌 XX等学长的热心帮助下完成。非常感谢凌老师在实验上的指点，学习上的帮助以 及在论文完成过程中的精心修改。在此向凌老师表达我深深的敬意和由衷的感谢。毕业论文代表着大学的终结，完成它既有一种收获感，又有一种失落感。作 为一个本科生的毕业论文设计，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周全的地方， 如果没有导师的督促指导，以及一起工作的同学们的支持，想要完成这个设计是 难以想象的。在这里，再次感谢我论文的指导老师凌铁军老师，再次感谢实验室的学哥学姐们，以及共同合做实验的同学们，他们在本实验进行

24、中，给予我许多指导和帮助，让我在实验中少走了许多弯路，让我的实验进行的更加顺利。在此 本论文完成之际，感谢给予我指导和帮助的老师、师兄师姐及共同合作的同学们， 祝你们工作顺利，学业有成！主要参考文献1 丁立生、陈耀祖、吴凤锷 . 岩筋菜的化学成分的研究，中国中药杂志， 1991年 第 18 卷第 5 期2 付润华、齐桂年 . 黑茶渥堆作用的研究进展与展望 . 四川农业大学林学与园 艺学院，福建茶叶， 2007年第四期 .3 宋淑平 . 绿茶的制作工艺 .中小企业科技， 2006年5月.4 杨抚林、邓放明、赵玲艳、夏岩石 . 茯砖茶发花过程中优势菌的研究进展 . 茶 叶科学技术，湖南农业大学食品

25、科技学院， 2005年第一期 .5 林智、吕海鹏、崔文锐等 . 普洱茶的抗氧化酚类化学成分的研究 J. 茶叶科 学, 2006, 26(2): 112116.6 周志宏、杨崇仁 . 云南普洱茶原料晒青毛茶的化学成分 J. 云南植物研究 , 2000, 22(3): 343350.7 吕海鹏、谷记平、林智、郭丽、谭俊峰、彭群华 . 普洱茶的化学成分及生物活 性研究进展，茶叶科学， 2007， 27(1)：818.8 折改梅、张香兰、陈可可、张颖君、杨崇仁 . 茶氨酸和没食子酸在普洱茶中含 量的变化，中国科学院昆明研究所植物化学与西部植物资源可持续利用国家重点 实验室，云南植物研究， 2005年第

26、 5期.9 吕海鹏、林智、谷记平、郭丽、谭俊峰 . 普洱茶中的没食子酸研究，茶叶科学， 2007，27（2）：104110.10 傅冬和、刘仲华、黄建安、陈惠衡 . 茯砖茶不同萃取物对消化酶活性的影响， 茶叶科学， 2008， 28（1）：6266.11 傅冬和、刘仲华、黄建安、陈金华、陈惠衡 . 茯砖茶中几种单体成分功效的 高通量筛选研究，茶叶科学， 2008，28（1）：3942.12 左东东、刘来田 . 茶叶保健功能与应用，信息科技 .13 王龙、孙建设 . 黄酮类的化学结构及其生物学功能，河北农业大学，园艺学 院，河北农业大学学报， 2003年5月第 26卷增刊.14 胡秀芳、杨贤强、

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28、02年第二期 .19 戴军、王洪新、陈尚卫、汤坚 . 茶叶及茶多酚中儿茶素的高效液相色谱分析 方法的研究，无锡轻工大学，色谱， 2001年第五期 .20 朱旗、M.N.Clifford 、毛清黎、邓放明丄C-MS分析普洱茶和茯砖茶与红茶成 分的比较研究，茶叶科学， 2006，26（3）：191194.21 吴玉蓉、翟成尘、莫尚武 . 四川瓜蒌具钙拮抗左右化学成分的光谱研究，化学 研究与应用，第 13卷第 2期，2001年 4月.The Spinasterol Isolation and Identification ofFuzhuan Brick-TeaAuthor: Chunfeng Zha

29、ng Supervisor:Tiejun Ling( Anhui Agricultural University, school of tea&food science ,food quality and safety , Hefei 230036)Abstract: Fuzhuan brick-tea is one kind of dark tea in China ， mainly produced in Hunan province. The application of tea has been proved to have hypolipidemic effects and othe

30、r health care in the long-term practice.Fuzhuan brick-tea ingredients study was not thorough at present, to elucidate the function of health, at first weextracted by organic solvent. Based on the principle of similar miscibility and the difference of polarity in solvents, we extracted as followed, t

31、o make the extraction of different polarity parts, assigned to the corresponding solvent. Adsorption chromatography used for separation of these parts, then we used silica column chromatography and RP-column methods .etc, to make compounds separated pure as far as possible in this operation. And the

32、n we used modern identification methods of natural products, identified the substances isolated structure, finally, get a white needle crystal material. Through nuclear magnetic resonance spectra of carbon, hydrogen spectrum analysising, it can be determined that the substance is spinasterol, which

33、was found in rock tendon dishes.Keywords: Fuzhuan brick-tea, Column chromatography, NMR, Spinasterol, The function of healthppm19313 1713616305.15552 13385 05977.03B15.021S25.00!3 w 丘5u吿 es PU -s s SFSfHF pnKlts.Hg 口障 Ygru KSPHHe*S-W0SSEx0FSWJ0百 M4 P10L pfaanrs ff1呂丹 rlY 9-8 s r-p0 30 8aFL sors 5 “零

34、 Q3D0EM -i ? 3RK _0 5 Eal XM? 】7-蛊當6, Hzrn.0?330.01297E963?8 s&4&5693780.811S1 7&398.7?613 .76873.7625175160.7-1421口 70679.50637.96177.54057.52630.4945746622” 4 旳&5.4S315452951 443641.434791. 4 25旳1-41915-1引0阴 0143 】.3B50J1 37116 】318811 287951 273M1.260451.347101.?34511901.4 门网09160 佃凸3 0301602160922010.861910.日跖射D.B2B2J0 BIOGd0.B02730.795760.79174-0.56-35353995J 53003弓吗,4 mg PIPfFLBr * -kmdtsal1S8 ESIrs盖 TxMBS 1苔MUEMTwrHriWESHEEH3TDm&cnss&vBBC E6J.H 第36 gw2ms再0 一黑畧霄fcoauj556h unn善氐4-呂 curanF1呂霊2SCI 吕sa s p首 Damm-艮 = -_-_.K88 st -n I g s s & es ”1 s 5FE営 50_s Humfki Rr 聶Mwnf parmBeuS