色谱法本科生教学中文版

1、1 生物化学实验教学 2 实验内容： v1.1.生物化学常用四大技术（分光光度法血糖生物化学常用四大技术（分光光度法血糖 测定，蛋白定量分析；色谱法离子交换色谱和测定，蛋白定量分析；色谱法离子交换色谱和 凝胶色谱；电泳法醋酸纤维薄膜电泳；聚丙烯凝胶色谱；电泳法醋酸纤维薄膜电泳；聚丙烯 酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳；离心质粒酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳；离心质粒 DNADNA的小量快速制备中使用）的小量快速制备中使用） v2.GPT2.GPT酶活性测定酶活性测定 v3.3.过氧化氢酶过氧化氢酶KmKm值测定值测定 v4.4.酶竞争性抑制酶竞争性抑制 v5.5.实验操作考试实验操作考试 v6.6.

2、课堂讨论及课堂答疑课堂讨论及课堂答疑 3 色谱法色谱法 4 第一节第一节 概述概述 v 色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家 茨维特分离植物色素时采用。他在研究茨维特分离植物色素时采用。他在研究 植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃 取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内， 然后加入石油醚使其自由流下，结果色然后加入石油醚使其自由流下，结果色 素中各组分互相分离形成各种不同颜色素中各组分互相分离形成各种不同颜色 的谱带。这种方法因此得名为的谱带。这种方法因此得名为色谱法色谱法 （chromatograp

3、hy)chromatography)。又称层析法。又称层析法。 5 石油醚（流动石油醚（流动 相相M M） 碳酸钙（固定相碳酸钙（固定相S S） 玻璃管（色谱柱）玻璃管（色谱柱） 胡萝卜素、叶黄素胡萝卜素、叶黄素 和叶绿素和叶绿素A A、B B 连续色带连续色带 （色谱）（色谱） 植物叶子的石油醚萃取液植物叶子的石油醚萃取液 6 第一节第一节 概述概述 v在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静 止不动的一相（固体或液体）称为止不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相 ； 自上而下运动的一相（一般是气体或液体）自上而下运动的一相（一般是气体或液体） 称为称为

4、流动相流动相 ；装有固定相的管子（玻璃管或；装有固定相的管子（玻璃管或 不锈钢管）称为不锈钢管）称为色谱柱色谱柱 。 7 第一节第一节 概述概述 v当流动相中样品混合物经过固定相时，就会当流动相中样品混合物经过固定相时，就会 与固定相发生作用，由于各组分在性质和结与固定相发生作用，由于各组分在性质和结 构上的差异，与固定相相互作用的类型、强构上的差异，与固定相相互作用的类型、强 弱也有差异，因此在同一推动力的作用弱也有差异，因此在同一推动力的作用下， 不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而 按先后不同的次序从固定相中流出。按先后不同的次序从固定相中流出。

5、8 第一节 概述 v色谱法色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差是利用混合物中各组分的理化性质的差 异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子 极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度 分布在两个相中，其中一个相叫固定相分布在两个相中，其中一个相叫固定相 （stationary phasestationary phase），另一相流过此固定相），另一相流过此固定相 叫做流动相（叫做流动相（mobile phasemobile phase）。由于各组分受）。由于各组分受 流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的流动相

6、作用产生的推力和受固定相作用产生的 阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度， 从而使结构上只有微小差异的各组分得到分离。从而使结构上只有微小差异的各组分得到分离。 9 第一节第一节 概述概述 特点：特点： v1 1具有极高的分辨效力具有极高的分辨效力：同系物、同分异构体，：同系物、同分异构体， 甚至同位素。甚至同位素。 v2 2具有极高的分析效率：具有极高的分析效率：HPLC(high performance HPLC(high performance thin layer liquid chromatography)thin layer liquid

7、chromatography)一次仅一次仅1010分分 钟就可完成钟就可完成4040个样品的点样和分析工作。个样品的点样和分析工作。 v3 3具有极高灵敏度具有极高灵敏度：样品组分含量仅数微克，或：样品组分含量仅数微克，或 不足一个微克都可进行很好的分析。不足一个微克都可进行很好的分析。 v4 4操作简便，应用广泛操作简便，应用广泛： 10 第一节 概述 从不同角度，可将色谱法从不同角度，可将色谱法分类分类如下：如下： 1. 1.按两相状态分类按两相状态分类 v气体为流动相的色谱称为气体为流动相的色谱称为气相色谱（气相色谱（GCGC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液又可根据固定相是固体吸附剂

8、还是固定液又可 分为气固色谱（分为气固色谱（GSCGSC）和气液色谱（和气液色谱（GLCGLC）。）。 11 第一节 概述 v液体为流动相的色谱称液体为流动相的色谱称液相色谱（液相色谱（LCLC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱同理液相色谱亦可分为液固色谱 （LSCLSC）和液液色谱（和液液色谱（LLCLLC）。）。 12 第一节 概述 2. 2. 按分离机理分类按分离机理分类 v利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不 同而得以分离的方法，称为同而得以分离的方法，称为吸附色谱法吸附色谱法。 v利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到利用组分在

9、固定液（固定相）中溶解度不同而达到 分离的方法称为分离的方法称为分配色谱法分配色谱法。 v利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小 不同而达到分离的方法，称为不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。离子交换色谱法。 13 第一节 概述 v利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而 达到分离的方法，称为达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱凝胶色谱法或尺寸排阻色谱 法。法。 v将具有生物学活性（如酶将具有生物学活性（如酶、辅酶、抗体等）的配位、辅酶、抗体等）的配位 基，键合到载体或基质表面形成固

10、定相。利用蛋白基，键合到载体或基质表面形成固定相。利用蛋白 质或生物大分子与亲和色谱固定相配位基的亲和力质或生物大分子与亲和色谱固定相配位基的亲和力 进行分离的色谱法，进行分离的色谱法，称为称为亲和色谱法。亲和色谱法。 14 第一节 概述 3. 按操作形式不同分类按操作形式不同分类 v柱色谱法：柱色谱法：固定相装于柱内的色谱法。固定相装于柱内的色谱法。 v平面色谱法：平面色谱法：色谱过程在固定相构成的平面层内进色谱过程在固定相构成的平面层内进 行的色谱法，包括纸色谱法行的色谱法，包括纸色谱法、薄层色谱法和薄膜色、薄层色谱法和薄膜色 谱法。谱法。 15 第二节第二节 常用的色谱方法常用的色谱方法

11、 16 （一）基本原理：（一）基本原理： 利用不同的生物大分子的带电部分与利用不同的生物大分子的带电部分与 具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同， 经过强弱不同的洗脱剂进行洗脱从而达到经过强弱不同的洗脱剂进行洗脱从而达到 分离目的。分离目的。 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） 17 离子交换剂：离子交换剂： 藉酯化、氧化或醚化等化学反应在藉酯化、氧化或醚化等化学反应在琼琼 脂糖、纤维素或凝胶脂糖、纤维素或凝胶分子上引入分子上引入阳离子或阳离子或 阴离子阴离子基团的特殊剂型。当离子交换剂带基团的特殊剂型

12、。当离子交换剂带 阳离子基团时，可吸附阴离子样品称为阴阳离子基团时，可吸附阴离子样品称为阴 离子交换剂，如离子交换剂，如DEAEDEAE。反之，离子交换剂。反之，离子交换剂 带阴离子基团时，可吸附阳离子样品称之带阴离子基团时，可吸附阳离子样品称之 为阳离子交换剂，如为阳离子交换剂，如CMCM。 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） 18 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） 阳离子交换剂阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动分子中具有酸性基团，能和流动 相中的阳离子进行交换。例：相中的阳离

13、子进行交换。例： R RSOSO3 3 H H+ + + Na + Na+ +RRS OS O3 3 Na Na+ + + H + H+ + 阴离子交换剂阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动分子中具有碱性基团，能和流动 相中的阴离子进行交换。如：相中的阴离子进行交换。如： R RNHNH4 4 OH OH +Cl +Cl R RNHNH4 4+ + ClCl +OH +OH 19 Ion exchanger An ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups have been covalentl

14、y bound, the charged groups are associated with the mobile counter-ions (反离子). These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the same charge without altering the matrix. There are two kinds of ion exchangers. 20 Cation exchanger (阳离子交换剂) Cation exchangers have positively charged

15、counter-ions which can be exchanged with the cations in the mobile phase. RSO3 H+ + Na+RS O3 Na+ + H+ + + + + 21 Anion exchanger (阴离子交换剂阴离子交换剂) Anion exchangers have negetively charged counter-ions which can be exchanged with the anions in the mobile phase. RNH4 OH + ClRNH4f+ Cl + OH + + + + + + cou

16、nter ions 22 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） 分离样品时，主要依靠增加流动相的离子强度或改分离样品时，主要依靠增加流动相的离子强度或改 变酸碱度来进行洗脱。变酸碱度来进行洗脱。 增加流动相的离子强度增加流动相的离子强度：当缓冲液的离子强度增：当缓冲液的离子强度增 加时，即增加了它与生物大分子对交换基团竞争吸加时，即增加了它与生物大分子对交换基团竞争吸 附的能力，把生物大分子置换下来。附的能力，把生物大分子置换下来。 改变酸碱度：改变酸碱度：当缓冲液的当缓冲液的pHpH接近生物大分子的等接近生物大分子的等 电点时，其净电荷为零

17、，从而可被洗脱。电点时，其净电荷为零，从而可被洗脱。 23 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） （二）离子交换剂的类型：（二）离子交换剂的类型： 主要有离子交换树脂主要有离子交换树脂、离子交换纤维离子交换纤维 素素、离子交换琼脂糖和离子交换葡聚糖。常离子交换琼脂糖和离子交换葡聚糖。常 用的离子交换基团有用的离子交换基团有: :二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基 （DEAEDEAE）、羧甲基（）、羧甲基（CMCM）、磺酸基）、磺酸基等。等。 24 一、离子交换色谱离子交换色谱 （ion exchange chromatography） v（三）洗脱

18、方式：（三）洗脱方式： （1 1）分步洗脱法：）分步洗脱法：选用几种洗脱能力逐步增强的选用几种洗脱能力逐步增强的 洗脱液相继洗脱，适用于各组分对交换剂亲和洗脱液相继洗脱，适用于各组分对交换剂亲和 力比较悬殊的样品。力比较悬殊的样品。 （2 2）连续梯度洗脱法：）连续梯度洗脱法：选用离子强度和选用离子强度和pHpH呈连续呈连续 梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续 增强，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样增强，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样 品。品。 25 （四）具体实验应用：（四）具体实验应用： 26 1 1实验原理实验原理: : 离子交换剂：离

19、子交换剂：磺酸型阳离子交换树脂（磺酸型阳离子交换树脂（732732型）型） 分离的氨基酸分离的氨基酸：天冬氨酸（：天冬氨酸（Asp pI=2.97Asp pI=2.97）和赖）和赖 氨酸氨酸 （Lys pI=9.74Lys pI=9.74）的混合液。）的混合液。 洗脱方式：洗脱方式：改变洗脱液的改变洗脱液的pHpH值值 在在pH=5.3pH=5.3条件下，条件下，LysLys解离成阳离子挂在树脂解离成阳离子挂在树脂 上；上；AspAsp解离成阴离子，不能被树脂吸附而直接解离成阴离子，不能被树脂吸附而直接 流出色谱柱。流出色谱柱。 在在pH=12pH=12条件下，条件下，LysLys解离为阴离子

20、从树脂上被解离为阴离子从树脂上被 交换下来。交换下来。 27 阳离子交换色谱原阳离子交换色谱原 理示意图理示意图 . . 28 2操作步骤： （1 1）树脂的处理（）树脂的处理（2 2）装柱（已作好）装柱（已作好） （3 3）平衡（检查色谱柱有无裂痕和气）平衡（检查色谱柱有无裂痕和气 泡），调流速（泡），调流速（10-1210-12滴滴/ /分钟）分钟） （4 4）加样和洗脱（示教）加样和洗脱（示教） （5 5）收集）收集3 3管（管（一加样就开始收集一加样就开始收集，每管，每管 3ml3ml） （6 6）改换高）改换高pHpH洗脱液收集洗脱液收集4-104-10管管 29 2操作步骤： （7

21、 7）测定（收集管按顺序编号，每管取）测定（收集管按顺序编号，每管取0.5ml0.5ml于另于另 一试管，加入一试管，加入1ml pH=5.31ml pH=5.3洗脱液、洗脱液、0.5ml0.5ml茚三酮茚三酮 溶液，溶液，100100o oC C水浴水浴25min25min，水冷却，水冷却5-10min5-10min，加入，加入 60%60%乙醇乙醇3ml3ml，摇匀，摇匀，722722型分光光度计比色，波型分光光度计比色，波 长为长为570nm570nm，空白对照管空白对照管为柠檬酸洗脱液为柠檬酸洗脱液1.5ml1.5ml， 茚三酮茚三酮0.5ml,0.5ml,乙醇乙醇3ml3ml）, ,

22、绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线 （8 8）色谱柱再生（用）色谱柱再生（用pH=5.3pH=5.3洗脱液平衡）。洗脱液平衡）。 722S722S型分光光度计的使用方法（吸光型分光光度计的使用方法（吸光 度的测定）度的测定）： 1. 开机预热15min以上。 2. 转动波长选择钮，选用所需的波长。 3. 将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使 空白管对准光路。 4. 打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ 键， 即能自动进行机械零点的调整，数码显示为0.000。 5. 盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按100%ADJ 键 ，即能自动进行空白零点的调整，数码显示为100.0。（一次 如有

23、误差可再按一次） 6. 按MODE 键选择吸光度测定模式（ABS灯亮），数码显 示自动转换为吸光度值0.000。 7. 拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显 示上即可读出样品的吸光度 8. 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱 盖好，清洗比色杯并晾干。 31 二、凝胶色谱二、凝胶色谱 （gel chromatographygel chromatography） （一）基本原理：（一）基本原理： 凝胶色谱凝胶色谱是指混合物随流动相流经装有是指混合物随流动相流经装有凝凝 胶胶作固定相的色谱柱时，混合物中各种物质作固定相的色谱柱时，混合物中各种物质 因因分子大小不同分子大小不

24、同而被分离的技术。而被分离的技术。 32 二、凝胶色谱二、凝胶色谱 （gel chromatographygel chromatography） v凝胶：凝胶：是指一类具有三维空间多孔网状结构物质，是指一类具有三维空间多孔网状结构物质， 凝胶颗粒直径一般在凝胶颗粒直径一般在0.1-1mm0.1-1mm之间。之间。 v色谱过程与过滤相似，故又名色谱过程与过滤相似，故又名凝胶过滤凝胶过滤，其机理是，其机理是 分子筛效应分子筛效应。在洗脱过程中，分子大小不一的物质。在洗脱过程中，分子大小不一的物质 同时加入凝胶床，大分子因直径大于凝胶网孔，在同时加入凝胶床，大分子因直径大于凝胶网孔，在 凝胶颗粒间隙流动，阻滞小，流程短，先流出色谱凝胶颗粒间隙流动，阻滞小，流程短，先流出色谱 柱；小分子因直径小于网状结构的