(完整版)柱层析的操作步骤和注意事项

1、柱层析技术 常说的过柱子应该叫柱层析分离， 也叫柱色谱。 我们常用的是以硅胶或氧化铝作 固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多， 所以下面我就几年来过柱的体会写些心得， 希望能有所帮助。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板 数。所以其他条件相同的时候， 常压柱是效率最高的， 但是时间也最长， 比如天然化合 物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量， 感觉能够节省一半甚至更多， 但是由于大量的空 气通过硅胶会使溶剂挥发 （有时在柱子外面有水汽凝聚） ，以及有些比较易分解的东西 可能得不到，而且还必须同时使用

2、水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大 量的过减压柱，对它有比较深厚的感情， 但是自从尝试了加压后， 就几乎再也没动过减 压的念头了。加压柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。 压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。非凡是在轻 易分解的样品的分离中适用。 压力不可过大， 不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 个 人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子 上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想假如柱子

3、十厘米，而样品 就有二厘米，那么分离的难度可想而知， 恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。 而假如样 品层只有 0.5 厘米，那么各组分就比较轻易得到完全分离了。 当然采用粗大的柱子要牺 牲比较多的硅胶和溶剂了， 不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了 （有些不环保 的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1: 510,书中写硅胶量是样品量的3040倍， 具体的选择要具体分析。假如所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.20.4 ，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cmK 20cm 的柱子）；假如相差不到 0.1

4、 ，就要加大柱子， 我觉得可以增加柱子的直径， 比如用 3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱， 也可以干柱。 不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次， 因为溶 剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解， 究竟要分离的是敏感的东东， 小心不为 过。也是因为分离的东西比较敏感， 所以接收瓶一定要用可密封的， 遵循 schlenk 操作。 至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是 schlenk 操作，所以点板是个问题，假如 样品是显 色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。假如样品无色，只好预 备几十个 schlenk 瓶

5、，一瓶一瓶的点， 不过几次之后就知道样品在哪， 也就可以省些了。 像我以前过一根无水无氧柱，需要六个 schlenk ，现在只一个就能把所要的全收集到。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。 因为硅胶中有大量的羟基裸露 在外，很轻易是样品分解， 非凡是金属有机化合物和含磷化合物。 而氧化铝可以做成碱 性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用 紫外灯一 照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。 关于湿法、干法上样。湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但

6、溶剂越 少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。 很多样品在上柱前是粘乎乎的， 一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出， 这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和， 而样品本身又 是比较好的固体才会发生， 这就应该先重结晶， 得到大部分的产品后再柱分， 假如不能 重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMFQMS等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾） ，这时就必须用干法上柱了。 样品和硅胶的量有一种说 法是 1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说 明有的样品没有吸附

7、在硅胶上）。 溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中 有写用正己烷的，太贵了，除非非凡需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快， 不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是轻易睡觉，注重保持 清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅 胶的吸附是一个放热过程， 所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡， 天气冷的时候会 好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品假如想过元素分析的话要留神，应该 经过后继处理，比如说重结晶等。 其他的溶剂用的相对较少， 要依个人的不同需要选择 了。由于某些原因，用到的淋

8、洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用 10 升或 25 升的塑料桶装的， 就要注重这些工业品的纯度是较低的。 经常能够从送来的大桶底部看 见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。 当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用， 一方面环保，另一方面也能节省部分经费， 缺点是要消耗一定的人工。 这里要注重的是， 一般在过柱同时进行的是减压旋蒸， 石 油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化， 一般会使得极性变大， 在 梯度淋洗时比较合适， 正好极性越来越大了。 在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，

9、 因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来， 常压时就会减少这种现象， 假如 杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。 关于操作问题。1 装柱。 柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂， 会被淋洗剂带到产品中的， 可以采用四氟节 门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适 度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。 书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然假如你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！2加样。用

10、少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面 时，再加少量的低极性溶剂，然后俅蚩钊 绱肆饺危话闶熬突臼前咨 牧恕？加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。3淋洗剂的选择。感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比 较开，过柱子就用那种极性，假如rf在0.6，即使相差0.2也不轻易在柱子上分开，因 为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。4样品的收集。用硅胶作固定

11、相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以假如样品与硅胶的 吸附比较强的话，就不轻易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这 时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，非凡是小量样品，假如用大试管，可能 一根就收到了三个样品，wuwu假如都用小试管那工作量又太大。5最后的处理。柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以假 如想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的， 一洗基 本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是 和使用的溶剂有关，假如是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在 室温稍高的情况下，很轻