实验十一细菌质粒DNA的提取和纯化

1、实验一细菌质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理：1、细菌中有两种DNA即染色体DNA和质粒DNA2、 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Trit on 和SDS裂解法。3、 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞 DNA变性，共价闭合 环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质 粒DNA勺双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体 DNA隹以复性。当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与 DNA发生变性，当加入中和 液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，

2、离心时留在上清中；蛋白质与 染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒 DNA相对较小及共价闭环两个性质。 例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二 醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及 探针标记等要求，故在实验室中常用。三、实验材料：含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液四、实验用具和药品：实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃

3、试管（15mL及塞子、离心 管（1.5mL）。实验药品：溶液1（高压灭菌）：50 mmol/L葡萄糖25 mmol/L Tris.Cl （pH8.010 mmol/L EDTA （pH8.0溶液U （现用现配）：2 mol/L NaOH10% SDS（十二烷基硫酸钠）NaOH : SDS: ddHO=1:1:8溶液川：5 mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL五、实验步骤：（一）细菌繁殖第1天晚上：吸取含质粒的菌液2卩L,转移入2mLLB （加入相应抗生素）， 37C,过夜振荡（200r/min 培养。（二）菌体收集第2天早晨（时间：约2-3h左右）：1、将过夜培养的菌体转入

4、1.5mL离心管, 5000r/min 离心 30sec； 2、弃上清（三）碱裂解法提取质粒DNA1、 将上述沉淀重悬于100卩L冰预冷的溶液I中，剧烈震荡（须使沉淀完全 分散）（葡萄糖：悬浮细胞；EDTA抑制DNAase）2、 加入200卩L溶液U,盖紧管口，轻柔颠倒离心管 510次，该过程应小 于5min； （ NaOH溶解细胞膜，释放 DNA SDS3、 加入150卩L冰预冷的溶液川，盖紧管口，温和地颠倒离心管 510次， 该过程大于5min；（乙酸钾：和SDS反应生成PDS（十二烷基硫酸钾），沉淀蛋 白，同时体积较大的染色体 DNA也一起沉淀；冰乙酸：中和NaOH）4、10000r/m

5、in 离心 5min；5、上清转移到另一新1.5mL离心管中；6加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置 2min （若沉淀不充分， 可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）；7、10000r/min 离心 5min；9、弃上清，干燥沉淀；9、加TE溶解沉淀，保存。六、实验作业：思考本实验的关键步骤是什么？答：本实验的关键是溶液I重悬须充分，溶液川混合须温和。碱裂解法的关 键是如何把握SDS-NaO处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于 NaOH,质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。 这些变性质 粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KO处理时间不能超过5分钟，最

6、好在冰 里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。七、注意事项：1、质粒的选取，尽量选择较小的松弛型质粒。2、提取过程应尽量保持低温3、溶液II不可冷冻,现用现配，加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠 倒几次离心管。复性时间不宜过长，一般是 5分钟，否则会使染色体复性。4、 沉淀DNA1常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完 全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把 盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。5、应用TE缓冲液溶解沉淀是为了在用苯酚、 氯仿抽提时，以减少DNA勺损 失。6 50%勺乙醇可溶解DNA故应该极其注意70%勺乙醇是否盖子完好，否则

7、稀 释的乙醇有可能将所获得DNA溶解掉。八、讨论与小结：1. 为什么用无水乙醇沉淀DNA用无水乙醇沉淀DNA这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是 可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应， 对DNA艮安全，因此 是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA周围 的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无 水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总 体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而

8、DNA损失也增大，尤其用多 次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。 也可以用0.6倍体积的异丙醇 选择性沉淀DNA 一般在室温下放置15-30分钟即可。2. 在用乙醇沉淀DNA寸，为什么一定要加 NaAc或NaCl至最终浓度达0.1 0.25mol/L ?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl， 使Na冲和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互 相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA形成 DNA钠盐而聚合，这样就造成DN

9、A沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其 效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在，影响DNA勺酶切等反应， 必须要进行洗涤或重沉淀。本次实验是能动性、严谨性很强的实验，因此通过这次实验，我们能把理论 和实践更好的联系在一起，将将理论应用到实践，提高了自己的实验能力，同时 也加深理论的理解。要成功完成实验，必须理论知识丰富，全面了解可能导致实验失败的因素， 在试 验中特别注意。时刻规范操作，否则容易导致实验失败。-点的痕迹，山风呼呼，细雨微微。人行翦翦，心韵盈盈。思邃恒古，本义使 然，让思想的光芒照亮每个心灵，让身心的热量变作普照大地的明媚，让 蠕风的蠢蠢欲动万木复苏的定格。在这片

10、神圣的土地上，色彩是洁净的象征，静物是可修复的抱朴，人 境是可绝缘的尘，合沓车马也无喧。吾生有无涯而也无涯，知也以有而随 无也，有有也者，有无也者，有未始有无也者，有未始有夫未始有无也者俄而有无矣，而未知有无之果孰有孰无也。今我则已有谓矣，而未知 吾所谓之其果有谓乎，其果无谓乎 ？摘自于庄子 齐物论多一事不如少一事，少一事不如没一事，没一事不如了一事，了一事不如空无一事。人之所以不幵心，那是因为想要的太多，人之所以不顺心, 是因为付出太少，之所以不如意，也是因为，总计较那些得与失。一念起千山万水，一念灭沧海桑田。念人念心念天念地，随心律动，心随所动，虽有嘉肴，弗食不知其旨也；虽有至道，弗学不知其善也。是故 学然后知不足，教然后知困。知不足，然后能自反也 ；知困，然后自强也。 故曰：教学相长也。她也惟有付之一叹，青年的容貌，盛气，都渐渐地消磨去了。她怕见旧时的挚友。她改变了的容貌，气质，无非添加