土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、 尿素分子的立体结构 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 水生耐热细菌Taq Taq ( Thermus aquaticus ( Thermus aquaticus ) ) 耐高温的Taq DTaq DNANA聚合酶 美国微生物学科布鲁克 （T.BrockT.Brock) ) 19661966年发现耐热细菌 培养基配方三 KH KH2 2POPO4 4 1.4g Na 1.4g Na2 2HPOHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 47H7H2 2O 0.2g O 0.2g 葡萄糖 10.0g10.0g 尿素 1.0g

2、1.0g 琼脂 15.0g15.0g 培养基配方二 KH KH2 2POPO4 4 3g 3g MgSO MgSO4 47H7H2 2O 3gO 3g NaNO NaNO3 3 2g 2g 葡萄糖 10.0g10.0g 尿素 3.0g3.0g 琼脂 15.0g15.0g 培养基配方一 KH KH2 2POPO4 4 3g 3g Na Na2 2HPOHPO4 4 1.4g 1.4g NaNO NaNO3 3 2g 2g MgSO MgSO4 47H7H2 2O 3gO 3g 葡萄糖 10.0g 10.0g 琼脂 15.0g15.0g （一）筛选菌株尿素细菌的分离 1.1.原理：根据某种微生物的

3、特殊营养要求或其对物理、化 学因素（营养、温度、pHpH等）的抗性而设计的。 选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生 长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基。 2.2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高 该菌的筛选效果。 3.3.方法：利用选择培养基来实现。 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生 长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一 个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统 计菌落数目的关键。为了保证结果准确， 通常将几个稀释度 下的菌液都涂布在 平板上，培养后再 选择菌落数在 3030300300的平板进行 计数。 同学平板1 1平板2 2平板3 3平均数评价

4、甲230230230230 乙2121212212256256163163 结论 启示 没有设置重复组，因此结果 不具说服力。 1 1个平板的计数结果与另2 2个 相差太远，说明在操作过程 中可能出现了错误。 不能简单地将3 3个平板的计数值用来求平均值。 在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能 增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑 所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误， 需要重新实验。 统计菌落数目 测定微生物数量的方法： 1.1.稀释涂布平板法（活菌计数法）：统计平板上的菌落数 2.2.显微镜直接计数： 3.3.滤膜法：是检测水样中

5、大肠细菌群的方法。 4.4.测定细胞重量法：此法分为湿重法和干重法 5.5.测定细胞总氮量或总碳量 利用血球计数板( 1.1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中 的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁 栏的公式进行计算。 在做本课题的实验时，A A 同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛 选出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择 出大约5050个菌落。 其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的 培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而 导致不能分

6、解尿素的细菌也能在该培养基上生长。 但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的 结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是， A A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出 令人信服的证据。 你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实 验结果的因素吗？ 究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。 是可以由其他同学用与A A同学一样的土样进行 实验，如果结果与A A同学一致，则证明A A无误；如果结果不同， 则证明A A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 是将A A同学配制的培养基在不加土样的情况 下进行培养，作为空白对照，以证

7、明培养基是否受到污染。 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置 是必不可少的。 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土左右， 再取样，将样品装入事先准备好的中。 微生物的种类土壤稀释倍数目标 分离土壤中所有细菌10104 4、10105 5、10106 6 平板上的菌落数应 为3030300300个，便于 准确计数。 分离土壤中的放线菌10103 3、10104 4、10105 5 分离土壤中的真菌10102 2、10103 3、10104 4 分离土壤中的尿素细菌10104 4、10105 5、10106 6、10107 7 （二）土壤稀释 二、实验设计 2.2.为什么分离不同

8、的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤 中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的 稀释范围相同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg/kg）是 不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细 菌数约为2 1852 185万，放线菌数约为477477万，霉菌数约为23.123.1万。 因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行 分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 10101 1 10102 210103 310104 410105 510106 610107 7 10g土壤 9ml 无菌水 9ml 无菌水 1ml 0.1ml 0.1m

9、l 0.1ml 0.1ml 10104 4 10104 4 10104 4 10105 5 10105 5 10105 5 10106 6 10106 6 10106 6 10107 7 10107 7 10107 7 稀释涂布平板法 组别培养基类型 是否涂 布接种 目 的 实验组 以尿素为唯一氮源 的选择性培养基 是 对照组 牛肉膏蛋白胨 培养基是 分离尿素细菌 用以判断选择性培养 基是否具有选择性 对设计实验的训练 稀释倍数 培养基 10103 310104 410105 510106 6 选 择 培 养 基 平板1 1242242210210202202102102 平板2 225025

10、024024086869898 平板3 3310310250250198198120120 平均数 牛肉膏蛋白胨 培养基 平板4 4 （对照） 培养基的种类情况 162162106106 例 次 不同浓度的平均菌落数 两稀释度 菌数之比 菌落总数 个/g/g或个/ml/ml 报告方式 个/g/g或个/ml/ml10101 110102 210103 3 1 1136513651641642020- -16400164001600016000或1.61.610104 4 2 22760276029629646461.61.638000380003800038000或3.33.310104 4 3

11、 32890289027127160602.22.227100271002700027000或2.72.710104 4 4 4不可计46504650513513- -513000513000510000510000或5.15.110105 5 5 5272711115 5- -270270270270或2.72.710102 2 6 6不可计3053051212- -30500305003100031000或3.13.110104 4 菌落计数方法 1.1.首先选取平均菌落数在3030300300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。 当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数

12、乘其稀 释倍数（见表中例）。 2.2.若有两个稀释度，其平均菌落数均在3030300300个之间，则应求出两者菌 落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2 2应报告其平均数，若大于2 2则 报告其中较小的菌落数( (见表中例2 2及例3)3)。 例：4646（10103 3）和296 296 （10102 2）均在3030300300之间， 则：464610103 329629610102 21.61.6， 应取二者的平均值。 4646103103296296102102 0.1(ml)0.1(ml) ( ) 2=3.7752=3.77510105 5 3. 3. 若所有稀释度的平均菌落数均大

13、于300300个，则应按稀释 度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之( (见表中例4)4)。 4. 4. 若所有稀释度的平均菌落数均少于3030个，则应按稀释 度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之( (见表中例5)5)。 5.5.若所有稀释度的平均菌落数均不在3030300300个之间，其 中一个稀释度大于300300个，而相邻的另一稀释度小于3030个 时，则以接近3030或300300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 ( (见表中例6)6)。 （三）微生物的培养与观察 微生物 的种类 培养温度培养时间观察时间 细 菌303037371 12d2d 每隔24h24h统计一次菌落 数，选取菌落数目

14、稳定 时的记录作为结果。 仔细观察并记录菌落 的（形状、大小、隆起 和颜色等方面）特征。 霉 菌252528283 34d4d 放线菌252528285 57d7d （圆形，假根状，不规则状） （光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状） （扩展，台状，凹面，凸面，乳头状） （整齐，波状，裂叶状，锯齿状） （无光泽，金属光泽，闪光） （油脂状，膜状，粘脆） 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥 形瓶中，塞好棉塞。 3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 1.1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落： 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被 杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数 目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 2.2.样品的稀释操作是否成功： 如果得到了2 2个或2 2个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明 稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 3.3.重复组的结果是否一