高效液相色谱

1、2021/2/61 高效液相色谱法的出现高效液相色谱法的出现 由于气相色谱只能分析由于气相色谱只能分析M1000、高沸点、难挥发、高沸点、难挥发、 热稳定差的样品就无能为力了热稳定差的样品就无能为力了,随着工业生产的需要随着工业生产的需要, 高效液相色谱的研究成为一个迫切课题。高效液相色谱的研究成为一个迫切课题。 液相色谱法开始阶段是用液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱大直径的玻璃管柱在室温在室温 和常压下用液位差输送流动相和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法称为经典液相色谱法, 此方法此方法柱效低柱效低、时间长时间长（常有几个小时）。（常有几个小时）。 在经典液相色谱法的基础上

2、在经典液相色谱法的基础上,于于60年代后期年代后期,气相色谱气相色谱 理论迅速发展以及理论迅速发展以及高压泵高压泵的研制成功的研制成功,为高效液相色为高效液相色 谱的发展奠定了基础谱的发展奠定了基础,高效液相色谱又称高压液相色高效液相色谱又称高压液相色 谱法谱法(HPLC),也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。 Stein和和Moore获得了获得了1972年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖 （研（研 制出氨基酸分析仪制出氨基酸分析仪 ） 返回 2021/2/62 高效液相色谱仪举例高效液相色谱仪举例 2021/2/63 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 与经典液相色谱比较与经典液相色谱比

3、较（四高）（四高） : 高压高压: 压力可达压力可达150300Kg/cm2。 高速高速: 流速为流速为 0.110.0 mL/min。 高效高效: 可达可达5000块塔板块塔板/米。在一根柱中同时分离成份可米。在一根柱中同时分离成份可 达达100种。种。 高灵敏度高灵敏度:紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng(1ng=109g)。同。同 时消耗样品少。时消耗样品少。 如用如用LichrosorbODS色谱柱色谱柱,采用梯度洗脱采用梯度洗脱,可在不到可在不到 0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分个组分. 2021/2/64 与气相色谱相比与气相色谱相比 高沸点、热不稳定

4、有机化合物及生化试样的高效分离分析高沸点、热不稳定有机化合物及生化试样的高效分离分析 方法。方法。 （l)l)气相色谱法分析对象只限于分析气相色谱法分析对象只限于分析气体气体和沸点较低的化和沸点较低的化 合物合物, ,它们仅占有机物总数的它们仅占有机物总数的2020。对于占有机物总数近。对于占有机物总数近8080 的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质, ,目前主要采目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)(2)气相色谱采用流动相是气相色谱采用流动相是惰性气体惰性气体, ,它对组分没有亲和力它对组分没有亲

5、和力, , 即不产生相互作用力即不产生相互作用力, ,仅起运载作用。而高效液相色谱法中流仅起运载作用。而高效液相色谱法中流 动相可选用动相可选用不同极性的液体不同极性的液体, ,选择余地大选择余地大, ,它对组分可产生一定它对组分可产生一定 亲和力亲和力, ,并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此, ,流动相对流动相对 分离起很大作用分离起很大作用, ,相当于相当于增加了一个控制和改进分离条件的参增加了一个控制和改进分离条件的参 数数, ,这为选择最佳分离条件提供了极大方便。这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 （3 3）气相色谱一般都在）气相色谱一般都在

6、较高温度较高温度下进行的下进行的, ,而高效液相色而高效液相色 谱法则经常可在谱法则经常可在室温条件室温条件下工作下工作。 2021/2/65 5-2高效液相色谱仪器结构高效液相色谱仪器结构 色谱仪器的流程由液体流动相的色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统输液系统、进、进 样系统、分离系统、检测系统、样系统、分离系统、检测系统、信号放大记录系统信号放大记录系统 组成组成,其中其中高压泵高压泵、色谱柱色谱柱和和检测系统检测系统是高效液相色是高效液相色 谱的主要部件。谱的主要部件。 复 式 阀 色 谱 控 制 室 混 合 室 回 瓶 收 高 压 泵 压 力 表 梯 度 洗 脱 检 测 器 （ 计

7、算 机 ） 记 录 仪 柱 水 六 通 阀 进 样 口 醇 甲 图 2.4 高 效 液 相 色 谱 仪 流 程 图 返回 2021/2/66 输液系统输液系统 包括流动相储液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、包括流动相储液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、 压力脉动阻尼器、梯度洗脱装置等部件组成压力脉动阻尼器、梯度洗脱装置等部件组成 返回 2021/2/67 脱气装置脱气装置 脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体。脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体。(1)(1)脱气是为了防止脱气是为了防止 流动相从高压柱内流出时流动相从高压柱内流出时, ,释放出气泡。这些气泡进入检测释放出气泡。这些气泡进入检测 器后会使噪声剧

8、增器后会使噪声剧增, ,甚至不能正常检测。甚至不能正常检测。(2)(2)溶解氧会与某些溶解氧会与某些 流动相与固定相作用流动相与固定相作用, ,破坏它们的正常功能。对水及极性溶破坏它们的正常功能。对水及极性溶 剂的脱气尤为重要剂的脱气尤为重要, ,因为氧在其中的溶解度较大。因为氧在其中的溶解度较大。 常用的脱气方法有常用的脱气方法有: : 低压脱气法低压脱气法: :电磁搅拌、水泵抽空电磁搅拌、水泵抽空, ,可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空 或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成, ,此法此

9、法不不 适于二元以上溶剂组成适于二元以上溶剂组成的流动相脱气。的流动相脱气。 吹氦脱气法吹氦脱气法: :氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中, ,在在0.50.5公斤厘米压力公斤厘米压力 下保持下保持10151015分钟分钟, ,氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出, ,此法简单此法简单 方便方便, ,适用于所有冲洗剂脱气适用于所有冲洗剂脱气, ,但由于氦气价格昂贵但由于氦气价格昂贵, ,在国内尚难于普及。在国内尚难于普及。 超声波脱气法超声波脱气法: :将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中, ,以水为

10、介质超声脱气。以水为介质超声脱气。 一般一般500ml500ml溶剂约需超声溶剂约需超声2030min2030min即可达到驱气目的。此法方便即可达到驱气目的。此法方便, ,不影响不影响 溶剂组成溶剂组成, ,并适用于各种溶剂并适用于各种溶剂, ,目前国内使用较为普遍。目前国内使用较为普遍。 返回 2021/2/68 高压泵高压泵 目前高效液相色谱使用的高压泵分为目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压恒压和和恒流泵恒流泵,恒流恒流 泵使输出的液体流量稳定泵使输出的液体流量稳定,而恒压泵则使输出的液体压力稳定。而恒压泵则使输出的液体压力稳定。 恒流泵中有恒流泵中有往复泵、累积型往复泵、注射泵往复泵

11、、累积型往复泵、注射泵,恒压泵恒压泵有气动放有气动放 大泵大泵。各种高压泵均具有以下性能。各种高压泵均具有以下性能: (1) 泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢普通耐酸不锈钢或或优质耐酸优质耐酸 不锈钢不锈钢。 (2) 能在高压下连续上作。通常要求耐压能在高压下连续上作。通常要求耐压4050MPacm-2,能在能在 824h连续上作连续上作,压力平稳。压力平稳。 (3) 输出流量范围宽。一般在输出流量范围宽。一般在0.0110mL/min。 (4) 输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器,大多数对流量大多数对

12、流量 变化敏感变化敏感,高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低基线降低基线 噪声噪声并获较好的并获较好的检测下限检测下限,流量控制的精密度应流量控制的精密度应小于小于1,最好最好 为为0.5,重复性最好为重复性最好为0.5。 返回 2021/2/69 往复泵往复泵 往复泵有两类往复泵有两类,一种是活塞式一种是活塞式,另一种是隔膜式另一种是隔膜式 形形 成成 脉脉 冲冲 式式 供供 液液 返回 2021/2/610 累积型往复泵累积型往复泵 累积型往复泵有两个泵头累积型往复泵有两个泵头,以串联方式连接在一起以串联方式连接在一起,这样这样 可以提供平稳的液流。

13、所以如此是因为两级泵腔排液体积不可以提供平稳的液流。所以如此是因为两级泵腔排液体积不 同同,第一级泵腔是第二级泵控的一倍第一级泵腔是第二级泵控的一倍 1-高压流动相出口高压流动相出口;2-二级活塞二级活塞;3-一级活塞一级活塞;4-流动相流动相 返回 2021/2/611 注射泵注射泵 注射泵类似于注射器注射泵类似于注射器,用一台步进电机驱动注射泵的活塞把用一台步进电机驱动注射泵的活塞把 液流从泵腔中挤出泵腔体积较大液流从泵腔中挤出泵腔体积较大(250500mL),密封性好的活密封性好的活 塞把泵腔中的液体等速流出塞把泵腔中的液体等速流出. 1-电机电机;2-涡轮涡轮;3-螺旋螺旋;4-螺杆螺

14、杆;5-活塞活塞;6-至色谱柱至色谱柱 返回 2021/2/612 气动放大泵气动放大泵 气动放大泵是利用气体为动力源气动放大泵是利用气体为动力源 。适合于液相。适合于液相 色谱柱的装填色谱柱的装填,近代的液相色谱仪不用这种泵。近代的液相色谱仪不用这种泵。 1-接色谱柱接色谱柱;2-流动相入口流动相入口;3-高压气入口高压气入口;4-气体放空气体放空 返回 2021/2/613 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 外梯度外梯度: 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合 室室,用高压输液泵混合液输入色谱柱。用高压输液泵混合液输入色谱柱。 2021/2/614 内梯

15、度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 2021/2/615 进样系统进样系统 通常使用耐高压的通常使用耐高压的六通阀进样装置六通阀进样装置和和自动自动 进样系统进样系统。分。分部分进样部分进样和和整体进样整体进样。 返回 2021/2/616 自动进样系统自动进样系统 2021/2/617 分离系统分离系统- -色谱柱色谱柱 柱材料及规格柱材料及规格 柱连接方式柱连接方式 柱温控制柱温控制 柱填充技术柱填充技术 返回 2021/2/618 柱材料及规格

16、柱材料及规格 柱体为直型不锈钢管柱体为直型不锈钢管,内径内径16mm,柱长柱长1050cm。发展趋势是。发展趋势是减小填料减小填料 粒度粒度和和柱径提高柱效柱径提高柱效。 采用直形柱管采用直形柱管,标准填充柱柱管内径为标准填充柱柱管内径为4.6mm或或3.9mm,长长1050cm,填料填料 粒度粒度510m时时,柱效达柱效达500010000块块/m理论塔板数。理论塔板数。 返回 2021/2/619 柱连接方式柱连接方式 柱接头通过柱接头通过过滤片过滤片与色谱柱管连接。在色谱柱管与色谱柱管连接。在色谱柱管 的上下的上下两端两端要安装过滤片要安装过滤片,过滤片一般用多孔不锈钢烧过滤片一般用多孔

17、不锈钢烧 结材料结材料,此烧结片上的孔径此烧结片上的孔径小于小于填料颗粒直径填料颗粒直径,却可让流却可让流 动相顺利通过动相顺利通过,并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以 保护色谱柱。保护色谱柱。 返回 2021/2/620 柱温控制柱温控制 以下几种情况需精确控制柱温以下几种情况需精确控制柱温: （1）在一些法定标准分析方法中）在一些法定标准分析方法中,要求保留时间具有要求保留时间具有再现性再现性。 （2）必须通过改变）必须通过改变柱温柱温来提高分离效率。来提高分离效率。 （3）对）对高分子化合物高分子化合物或或粘度大粘度大的样品的样品,柱温必须柱温必须高于高

18、于室温。室温。 （4）具有）具有生物活性生物活性的生物分子的生物分子,要求分析时柱温应要求分析时柱温应低于低于室温。室温。 （5）对某些组成）对某些组成复杂复杂的样品的样品,在单一色谱柱不能实现完全分离在单一色谱柱不能实现完全分离,需要需要 使用使用二维色谱技术二维色谱技术,利用柱切换利用柱切换,使两根色谱柱在不同柱温下操作使两根色谱柱在不同柱温下操作, 以实现多组分的完全分离。以实现多组分的完全分离。 返回 2021/2/621 柱填充技术柱填充技术 填充色谱柱的方法填充色谱柱的方法,根据固定相微粒的大小根据固定相微粒的大小 有干法和湿法两种。微粒大于有干法和湿法两种。微粒大于20m的可用的

19、可用 干法填充干法填充,要边填充边敲打和震动要边填充边敲打和震动,要填得均要填得均 匀扎实。直径匀扎实。直径10m以下的微粒以下的微粒,不能用干法不能用干法 填充填充,必须采用湿法。必须采用湿法。 干法装柱与气相色谱法相似。干法装柱与气相色谱法相似。 湿法装柱又称等密度匀桨装填法。湿法装柱又称等密度匀桨装填法。 返回 2021/2/622 湿法装柱湿法装柱 常用常用对二氧六环对二氧六环和和四氯化碳四氯化碳,或叫氯乙烯和四溴乙烷或叫氯乙烯和四溴乙烷 等溶剂等溶剂,根据固定相的密度不同根据固定相的密度不同,采用不同的溶剂比例采用不同的溶剂比例, 配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂。配成密度与固定

20、相相似的混合液为匀浆剂。 1-顶替液槽顶替液槽;2-高压泵高压泵;3-压力表压力表;4-三通阀三通阀;5-匀浆罐匀浆罐;6-色谱色谱 柱柱;7-废液槽废液槽 返回 2021/2/623 检测系统检测系统 高效液相色谱检测器按适用性分为高效液相色谱检测器按适用性分为选择选择 性检测器性检测器和和通用型检测器通用型检测器。 紫外和紫外紫外和紫外- -可见分光光度检测器可见分光光度检测器 示差折光检测器示差折光检测器 荧光检测器荧光检测器 电化学检测器电化学检测器 返回 2021/2/624 紫外和紫外紫外和紫外-可见分光光度检测器可见分光光度检测器 检测原理检测原理: 紫外及紫外紫外及紫外可见光吸

21、收光度检测器相当于一台吸收可见光吸收光度检测器相当于一台吸收 光度计光度计,在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与吸在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与吸 光度的关系遵循光度的关系遵循Beer定律定律: A=log(I0/I)=bc 式中式中:A为吸光度为吸光度,I0为入射光强度为入射光强度,I为透射光强度为透射光强度,是样是样 品的摩尔吸光度品的摩尔吸光度,b为流通池的光程长度为流通池的光程长度,c为样品浓度。为样品浓度。 2021/2/625 示差折光检测器示差折光检测器 检测器原理检测器原理: 示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变

22、 化来测定样品的浓度。各种物质都具有不同的折射率化来测定样品的浓度。各种物质都具有不同的折射率, 溶液的折射率是溶剂溶液的折射率是溶剂(洗脱剂洗脱剂)和溶质和溶质(待测组分待测组分)各自的各自的 折射率乘以各自的摩尔浓度之和。设溶液的折射率为折射率乘以各自的摩尔浓度之和。设溶液的折射率为 n,则则: 式中式中c1和和c2为溶剂和溶质的为溶剂和溶质的摩尔分数摩尔分数,c1+c2=1;n1和和n2 为溶剂和溶质的折光指数。为溶剂和溶质的折光指数。 2211 ncncn 2121 212122122211 )( )()1 ( cnnnnn cnnnncncncncn 2021/2/626 荧光检测器

23、荧光检测器 检测原理检测原理: 当某些溶液受紫外光照射后当某些溶液受紫外光照射后,能吸收紫外光线能吸收紫外光线 而处于不稳定的激发状态而处于不稳定的激发状态,紧接着紧接着辐射出辐射出比紫比紫 外光波更长的光线外光波更长的光线,即荧光。在被测溶质浓度即荧光。在被测溶质浓度 较低时较低时,溶质受激发而发生的溶质受激发而发生的荧光强度荧光强度与被测与被测 溶质的溶质的浓度成正比浓度成正比关系。关系。 2021/2/627 仪器结构仪器结构 高灵敏度、高选高灵敏度、高选 择性择性; 对多环芳烃对多环芳烃,维维 生素生素B、黄曲霉素、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾、

24、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应类化合物等有响应; 返回 2021/2/628 电化学检测器电化学检测器 电化学检测器是根据电化学分析方法而设计电化学检测器是根据电化学分析方法而设计 的检测器。主要有两种类型的检测器。主要有两种类型:一种是根据溶液一种是根据溶液 的的导电导电性质性质,通过测定流经检测器的离子溶液通过测定流经检测器的离子溶液 电导率的大小来测量离子浓度电导率的大小来测量离子浓度,此类检测器是此类检测器是 高效离子色谱高效离子色谱采用的主要检测器采用的主要检测器;另一类是根另一类是根 据化合物在据化合物在电解池中工作电极上电解池中工作电极上发生的发生的氧化氧化- 还原反应还原反

25、应,通过测量通过测量电位电位、电流电流和和电量电量来确定来确定 化合物在溶液中的化合物在溶液中的浓度浓度。 返回 2021/2/629 5-3高效液相色谱基本原理高效液相色谱基本原理 表征液相色谱柱填充性能的重要参数表征液相色谱柱填充性能的重要参数 总孔率、柱压力降总孔率、柱压力降和和柱渗透率柱渗透率 高效液相色谱塔板理论高效液相色谱塔板理论 高效液相色谱的速率理论高效液相色谱的速率理论 返回 2021/2/630 总孔率总孔率 式中式中: :FF流动相的体积流速流动相的体积流速, ,cmcm3 3s s; ; u u流动相的平均线速流动相的平均线速,cm/s;,cm/s; r r一柱内径的半

26、径一柱内径的半径,cm;,cm; t tM M柱的死时间柱的死时间; ; L L柱长柱长,cm;,cm; V V色谱柱的空体积色谱柱的空体积,cm,cm3 3。 T T表达了色谱柱填料的多孔性能表达了色谱柱填料的多孔性能, ,当使用全多孔硅胶固定相当使用全多孔硅胶固定相 时时, ,T T约为约为0.85,0.85,使用非多孔的玻璃微珠使用非多孔的玻璃微珠( (或硅胶或硅胶) )固定相时固定相时,T T约约 为为0.40,0.40,可认为是柱中颗粒之间的孔率可认为是柱中颗粒之间的孔率, ,用用表示。表示。 返回 2021/2/631 柱压力降柱压力降 式中式中 一流动相的粘度一流动相的粘度, ,

27、MPas;MPas; k k0 0色谱柱的比渗透系数色谱柱的比渗透系数; ; d dp p固定相颗较直径固定相颗较直径, ,m;m; 色谱柱的阻抗因子色谱柱的阻抗因子; ; P P1 1、P P0 0色谱柱的入口压力和出口压力色谱柱的入口压力和出口压力,MPa,MPa。 返回 2021/2/632 柱渗透率柱渗透率 柱渗透率柱渗透率KF :表示流动相通过柱子的难易程度。在高表示流动相通过柱子的难易程度。在高 效液相色谱法中效液相色谱法中,由于使用液体流动相由于使用液体流动相,其其粘度粘度大于气大于气 体流动相体流动相,且固定相粒度又小且固定相粒度又小,为保证柱子在较低压力为保证柱子在较低压力

28、下正常操作下正常操作,总希望柱渗透率要大。总希望柱渗透率要大。 返回 2021/2/633 高效液相色谱的速率理论高效液相色谱的速率理论 其中其中:Cd为填充系数为填充系数,为一常数为一常数; Cm是容量因子是容量因子k的函数的函数,为一常数为一常数,其值取决于柱直径、其值取决于柱直径、 形状和填充状况形状和填充状况,当柱填充均匀紧密时当柱填充均匀紧密时,其值下降其值下降; Csm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的 分数以及容量因子分数以及容量因子k有关有关,为一常数为一常数; Cs是与容量因子是与容量因子k有关的常数有关的常数; Dm为组分在流动

29、相中的扩散系数为组分在流动相中的扩散系数,比气相扩散系数比气相扩散系数 小小45个数量级个数量级; Ds为组分分子在固定液内的扩散系数为组分分子在固定液内的扩散系数; u D dC D dC D dC u DC dCu u B AH s fs m psm m pm md p )(2 222 返回 2021/2/634 5-4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 一、液相色谱的流动相一、液相色谱的流动相 流动相特性流动相特性 流动相类别流动相类别 流动相选择流动相选择 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题 返回 2021/2/635 （1）液相色谱的流动相又称为）液相色谱的

30、流动相又称为:淋洗液淋洗液,洗脱剂。流动洗脱剂。流动 相组成改变相组成改变,极性改变极性改变,可显著改变组分分离状况。可显著改变组分分离状况。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相）亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的即流动相的 极性极性小于小于固定相的极性固定相的极性,称为称为正相液正相液-液色谱法液色谱法,极性柱也称极性柱也称 正相柱。正相柱。 （3）若流动相的极性）若流动相的极性大于大于固定液的极性固定液的极性,则称为则称为反相反相 液液-液色谱液色谱,非极性柱也称为反相柱。非极性柱也称为反相柱。 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 流动相

31、的特性流动相的特性返回 2021/2/636 流动相类别流动相类别 按流动相按流动相组成组成分分:单组分和多组分单组分和多组分; 按按极性极性分分:极性、弱极性、非极性极性、弱极性、非极性; 按按使用方式使用方式分分:等度淋洗和梯度淋洗。等度淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节 流动相的极性或增加选择性流动相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间以改进分离或调整出峰时间 。 2021/2/637 流动

32、相选择流动相选择 在选择溶剂时在选择溶剂时,溶剂的溶剂的极性极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。 采用正相液采用正相液-液分配分离时液分配分离时:首先选择中等极性溶剂首先选择中等极性溶剂, 若组分的保留时间太短若组分的保留时间太短,降低溶剂极性降低溶剂极性,反之增加。反之增加。 也可在低极性溶剂中也可在低极性溶剂中,逐渐增加其中的极性溶剂逐渐增加其中的极性溶剂,使保使保 留时间缩短。留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序: 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙

33、酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小) 返回 2021/2/638 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用）尽量使用高纯度试剂作流动相高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免）避免流动相与固定相流动相与固定相发生发生作用作用而使柱效下降或损坏而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相酸性溶剂破坏氧化铝固定相 等

34、。等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并防止产生沉淀并 在柱中沉积。在柱中沉积。 （4）流动相同时还应）流动相同时还应满足检测器的要求满足检测器的要求。当使用紫外检。当使用紫外检 测器时测器时,流动相不应有紫外吸收。流动相不应有紫外吸收。 返回 2021/2/639 5-5 高效液相色谱梯度洗脱技术高效液相色谱梯度洗脱技术 一、单一洗脱剂一、单一洗脱剂: 二、等度洗脱二、等度洗脱:流动相的流动相的k值恒定值恒定 三、梯度洗脱三、梯度洗脱:改变流动相的改变流动相的k值值 梯度变化速率梯度变化速率 梯度范围梯度范围 返回 2021/2/640 等度

35、洗脱等度洗脱 返回 2021/2/641 梯度变化速率梯度变化速率 返回 2021/2/642 梯度范围梯度范围 是指两种流动相起止百分比之差。 如（起）80%水:20%甲醇20%水:80%甲醇（止） 初始的试探性实验可进行一次全范围梯度(即5 100B)。B是指甲醇或乙腈等。 返回 2021/2/643 5-6 高效液相色谱类型简介高效液相色谱类型简介 液液-固吸附色谱固吸附色谱 液液-液分配色谱液分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 离子色谱离子色谱 排阻色谱排阻色谱 亲和色谱亲和色谱 高效液相色谱分离方法的选择高效液相色谱分离方法的选择 返回 2021/2/644 液液-固吸附色谱固吸附色

36、谱 固定相固定相:固体吸附剂为,如硅胶、氧化铝等,较常使用 的是510m的硅胶吸附剂; 流动相流动相:各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理:组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸; 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点缺点:非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 返回 2021/2/645 液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）; 基本原理基本原理:组分在固定相和流动相上的分配; 流动相流动相:对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的 极性小于固定液的极性（正相色谱正相色谱）,反之,流动相的极性大于 固定液的极性

37、（反相色谱反相色谱）。正相与反相的出峰顺序相反; 固定相固定相:早期涂渍固定液,固定液流失较多,较少采用; 化学键合固定相化学键合固定相:（将各种不同基团通过化学反应键合到硅 胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 返回 2021/2/646 正相高效液相色谱正相高效液相色谱 正相高效液相色谱是指以亲水性的填料作固定相(如在硅胶 上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相),以疏水性溶剂或混合物 作流动相(如己烷)的液相色谱。在液相色谱发展的早期,类似于 气相色谱把含羟基、氨基或氰基的极性固定相涂渍在硅胶上这 样容易被流动相冲洗掉,现在几乎都使用键合固定相了。 固定相极性固定相极性大大 硅

38、胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离 异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 返回 2021/2/647 反相高效液相色谱反相高效液相色谱 反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料作固定相、 以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。如在 硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相,以极性强的水、

39、 甲醇、乙腈作流动相的高效液相色谱。 固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18，硅胶硅胶-苯基；苯基； 流动相极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流 动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离 解的化合物，如有机解的化合物，如有机有机酸、有机酸、有有机机碱和酚碱和酚类类。 返回 2021/2/648 时间，时间，min 固定相：固定相：C1固

40、定相：固定相：C8固定相：固定相：C18 硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯 可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。 返回 2021/2/649 正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系 正相色谱正相色谱 低极性流动相低极性流动相 反相色谱反相色谱 高极性流动相高极性流动相 中等极性流动相中等极性流动相 中等极性流动相中等极性流动

41、相 时间时间 时间时间 时间时间 时间时间 待测物极性：待测物极性：ABC 返回 2021/2/650 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充 剂剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单 的吸附的吸附,也不是单一的液液分配也不是单一的液液分配,而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定 哪种机理起主要作用。对多数键合相来说哪种机理起主要作用。对多数键合相来说,以分配

42、机理为主。以分配机理为主。 通常通常,化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）: Si-O-R:对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解,使酯链断裂使酯链断裂,因此只适于因此只适于 以不含水或醇的流动相。以不含水或醇的流动相。 Si-R(或或Si-N):不水解不水解,热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使 用水溶液作流动相时用水溶液作流动相时,其其pH应在应在4-8之间。之间。 Si-O-Si-R:不水解不水解,热稳定性好热稳定性好,在在pH2-8范围内对水稳定。范

43、围内对水稳定。 HClSiROSiiClSROHSi)( RSiClSiOHSi)( ROSiOHROHSi)( 33 RMgClRLiSOCl SOCl 2 2 硅硅烷烷化化方方法法三三 先先氯氯化化方方法法二二 硅硅酯酯化化方方法法一一 或或 化学键合固定相化学键合固定相 返回 2021/2/651 离子交换色谱离子交换色谱 固定相固定相:阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂; 流动相流动相:阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离 子离子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液; 基本原理基本原理:组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离 子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷

44、、存在形式等有关 。亲和力大,保留时间长; 阳离子交换:RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换:RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用 应用:离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸等。 返回 2021/2/652 固定相固定相 按固定相制作方法可分为按固定相制作方法可分为: 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型); 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型包括薄膜型)离子交换树脂离子交换树脂; 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 2021/2/653 流