口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析(20210303025618)

1、文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白B 6亚基配体 结合域多克隆抗体的制备和特性分析 作者:高闪电，常惠芸，独军政，王景锋，周建华，赵建勇，谢 庆阁 【摘要】目的：表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白06亚基配体 结合域B 6LBD,并制备兔抗P 6LBD多克隆抗体。方法：利用PCR方法 扩增整联蛋白3 6LBD基因片段，经BamH I和Xho I进行双酶切后连入 pGEX拟4T拟1原核表达载体，构建的pGEX拟4T拟1拟P 6LBD重组表达 质粒，转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，经IPTG诱导表达，SDS拟PAGE 鉴定融合蛋

2、白的表达并提取包涵体，纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋 白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体，以ELISA方法测定抗体效 价，并以Western blot鉴定其特异性。结果：SDS拟PAGE电泳分析显 示pGEX拟4T拟1拟B 6LBD诱导后表达一 Mr约为42 000的GST拟B 6LBD 融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋口纯化后，在电泳图片上显示较 为清晰的单一条带，用纯化GST拟P 6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的 多克隆抗体效价达1 ： 12 800以上，具有较高的特异性。结论：制备 了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白0 6LBD多克隆抗体，为 深入研究整联蛋白P 6在口蹄疫病毒感染过

3、程中的作用了奠定基础。 【关键词】口蹄疫病毒；受体；整联蛋0 3 6亚基；配体结合域; 多克隆抗体 Abstract AIM: To induce the expression of FMDV receptor integrin P 6 subunit ligand拟binding domain in E coli and prepare the rabbit polyclonal antibody against it METHODS: The fragment coding P 6 ligand拟binding domain was amplified by PCR and doubly

4、digested with BamH I and Xho I Then it was cloned into expression vector pGEX拟4T拟1 to obtain recombinant plasmid pGEX拟4T拟 1 拟 P 6LBD. After pGEX拟4丁拟1 拟 P 6LBD was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG, the expression of fusion proteins was identified by SDS拟PAGE, with inclusion body

5、prepared and fusion protein purified Then new Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody against B 6LBD GST拟 B 6LBD antiserum was obtained and the specificity of polyclonal antibody was detected by Western blot RESULTS: SDS拟PAGE demonstrated that the fusion protein GST拟 B 6LBD was

6、 expressed with the expected molecular weight at 42 000. A single clear band of GST拟 P 6LBD fusion protein appeared in SDS拟PAGE gel after purification. The titer of the polyclonal antibody was above 1 : 12 800 and it is of high specificity CONCLUSION: The successful preparation of rabbit anti pig P

7、6LBD polyclonal antibody with high affinity and specificity will lay a foundation for further research into the function of integrin P 6 in FMDV infection. Keywords FMDV; receptor; integrin P 6 subunit; ligand拟binding domain; polyclonal antibody 摘要目的：表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋口 B 6亚基配 体结合域P 6LBD,并制备兔抗B6LBD多克隆抗体

8、。方法：利用PCR方 法扩增整联蛋白B 6LBD基因片段，经BamH I和Xho I进行双酶切后连 入pGEX拟4T拟1原核表达载体，构建的pGEX拟4T拟1拟B 6LBD重组表 达质粒，转化大肠杆菌BL2KDE3)菌株，经IPTG诱导表达， SDS拟PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体，纯化目的蛋白。然后 用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体，以ELISA方法 测定抗体效价，并以Western blot鉴定其特异性。结果：SDS拟PAGE 电泳分析显示pGEX拟4T拟1拟B 6LBD诱导后表达一 Mr约为42 000的 GST拟B6LBD融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后，

9、在电泳 图片上显示较为清晰的单一条带，用纯化GST拟P 6LBD免疫新西兰大 耳白兔制备的多克隆抗体效价达1 ： 12 800以上，具有较高的特异性。 结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋fl P 6LBD多克 隆抗体，为深入研究整联蛋白B6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了 奠定基础。 关键词口蹄疫病毒；受体；整联蛋OP 6亚基；配体结合域; 多克隆抗体 口蹄疫(foot拟and拟mouth disease, FMD )是由口蹄疫病毒 (foot拟and拟mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄动物的一种急 性、热性、高度接触传染性并可远距传播的动物疫病。FMDV

10、是微小 核糖核酸病毒科(Picornaviridae) 口疮病毒属(Aphthovirus)的代 表性成员，主要通过与其受体整联蛋白相互作用感染宿主。目前己报 道了 4种RGD依赖性的FMDV整联蛋白受体(avBl、 a 3、 a v B6、a vP8),它们大都能与FMDV结构蛋fl VP1的G拟H突环上含有 的高度保守的Arg拟Gly拟Asp (RGD)基序位特异性结合1, 2。a v B 6整联蛋白不仅是决定FMDV嗜性的主要受体，而且在病毒与受体结 合随后的脱壳、复制等过程中也发挥着重要作用3。整联蛋白分子 由I型跨膜蛋白a、 P两亚基经非共价键连接组成异二聚体 (heterodime

11、r),整联蛋白B亚基靠近外侧N端的Mr为40 00050 000的氨基酸残基通过链内二硫键紧密折叠在一起，形成配体结合域 (Ligand拟binding Domain, LBD),与整联蛋口和配体结合有关4。 我们在获得B 6亚基基因的基础上进一步表达其配体结合域并制备其 多克隆抗体，为进一步研究a vB6整联蛋白受体在介导口蹄疫病毒 感染过程中的作用机制奠定基础。 1材料和方法 1.1材料原核表达载体pGEX拟4T拟1、猪整联蛋白B 6重组质 粒B612p由本室保存5;限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、DXA markerDNA片段纯化试剂盒、大肠杆菌BL21 (DE3) pLys均购

12、自 宝生物(大连)公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技 术有限责任公司；低Mr蛋白Maker购自中国科学院上海生物化学研究 所；异丙基拟B拟D拟硫代半乳糖苜(IPTG)、丙烯酰胺、Tris.十 二烷基璜酸钠(SDS)、过硫酸镀、TEMED、硝酸纤维素膜等均为国产 或进口分析纯。Protein Refolding Kit购自Novagen公司；弗氏完 全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG 购自中杉金桥公司。实验动物为8周龄的雄性新酋兰大耳白兔，由本 所动物房提供。 1.2方法 1.2. 1 pGEX拟4T拟1拟B6LBD重组表达载体的构建参考猪整联 蛋白B

13、 6亚基基因序列，设计一对引物：(P1) 5 拟GTGGGATGAAGATGAATTTACAACTGA拟3，;( P2 )5， 拟CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA拟3。以 B612p 重组质粒为模板, 用上述引物扩增B 6亚基配体结合域基因片段，反应体系为：10XPCR buffer 5 U L, dXTP 5 U L,上下游引物各 1 U L,质粒 0. 5 H L, Taq 酶0.5 UL,加双蒸水至50 UL;反应程序如下：94C 5 min, 94 C 1 min, 55C 30 s, 72C 40 s, 30 个循环后，72C终延伸 10 min。参 照 T

14、aKaRa Agarose Gel DNA Pur辻ication Kit ,然后和原核表达载 体pGEX拟4T拟1分别经BamH I和Xho I进行双酶切，回收后16C连接 3 h,将连接产物转化入BL21大肠杆菌感受态细胞，挑斑、于含有 60 mg/L氨节青霉素的LB培养基中培养，以碱裂解法制备质粒，然后 经PCR、酶切筛选阳性克隆，对初步鉴定阳性的克隆送上海生工生物 工程公司测序。 1.2.2 GST拟P6LBD融合蛋口的诱导表达 将测序正确的阳性克 隆原菌液用上述含有氨节的LB液体培养基进行1 ： 100稀释，置37C 220 r/min的条件下培养至A值为0. 40. 6后，加IPT

15、G (终浓度为1. 0 mmol/L)进行诱导，分别在0、2、3、4、5、及6h各时间点取1 mL菌液4C、5 000 g条件下离心集菌，分别加入适量1 X SDS拟PAGE 上样缓冲液作为样品，进行SDS拟PAGE鉴定目的蛋白表达后，依上述 方法诱导200 mL菌液，以备纯化目的蛋白。 1. 2. 3 GST拟B 6LBD融合蛋口包涵体的制备及纯化 参考Novagen 公司Protein Refolding Kit说明书进行包涵体的提取，然后将得到 的包涵体进行SDS拟PAGE,从凝胶上切下目的蛋白条带，装入蛋白透 析袋中，再加上1XSDS拟PAGE电泳缓冲液，尽量排出气泡，密封透 析袋，然

16、后将透析袋置于加有1XSDS拟PAGE电泳缓冲液的水平电泳 槽中，60 V电压进行电泳6 ho结束后，调换电极，反向电泳5 mine 收集袋内液体即为纯化产物，取适量样品进行SDS拟PAGE鉴定纯化产 物。 1.2.4抗血清的制备 纯化的GST拟P6LBD融合蛋白与佐剂以 1：1的比例(W/W)超声乳化混匀，于2只雄性新西兰兔(2. 0 kg/只) 背部皮下多点注射进行免疫，初免用弗氏完全佐剂乳化抗原，之后均 采用弗氏不完全佐剂乳化抗原。每只兔于0、3、4及5周进行免疫， 每次免疫的抗原量约100 Ug。第3次免疫后7 d即少量取.血，分离 血清测定效价。第4次免疫后10 d取兔全血，常规方法

17、收集血清， -20C保存备用。 1.2.5多克隆抗体的鉴定第3次免疫后7 d采血分离血清作为 一抗，用纯化的GST拟P 6LBD融合蛋白作为抗原包被聚苯乙烯反应板, 间接ELISA法测定抗体效价。取未诱导的pGEX拟4T拟1拟B 6LBD菌、诱 导的pGEX拟4T拟1拟B 6LBD菌、诱导的pGEX拟4T拟1空载体菌以及纯 化的GST拟P 6LBD融合蛋白制样电泳，电转印于硝酸纤维素膜上进行 Western blot检测抗体的特异性，一抗用1 ： 1 000稀释的免疫兔.血 清，二抗用1 ： 15 000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。2 结果 2. 1 3 6LBD基因片段的扩增以B

18、612p重组质粒为模板，扩增得 到P6LBD基因片段，大小约为500 bp,与预期结果一致（图1）。 2.2表达载体的构建将酶切的PCR产物及载体连接、转化、挑 斑、摇菌、提取质粒后经电泳、PCR、酶切、测序鉴定重组质粒, 结果证明目的片段己插入载体中，且读码框正确。 2.3 GST拟P6LBD融合蛋口的诱导表达及包涵体的制备及纯化 取诱导表达各时间段样品、制备的包涵体裂解液及纯化产物进行 SDS拟PAGE,电泳结果显示重组菌诱导裂解物在Mr 42 000处可见1 条特异的蛋白条带，与预期大小一致，阴性对照未出现表达条带，而 且重组菌在IPTG终浓度为1 mmoL/L诱导5 h时表达量最大（图

19、2）。 可溶性分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在，提取和裂解包涵 体后，将提取的包涵体进一步用切胶纯化的方法进行纯化， SDS拟PAGE结果为较为清晰的单一条带（图3）。 2.4兔抗GST拟B6LBD血清的效价测定及特异性检测用间接 ELISA法对抗体进行效价测定，结果表明抗体效价约为1 : 12 800o通 过转印未诱导的pGEX拟4T拟1拟P 6LBD菌样、诱导的pGEX拟4T拟1拟 P 6LBD菌样、诱导的pGEX拟4T拟1空载体菌样以及纯化的GST拟B 6LBD融合蛋口进行Western blot检测了 B 6LBD抗体的特异性与高效 性。结果只有诱导的pGEX拟4T拟1拟B 6L

20、BD菌、纯化的GST拟P 6LBD 融合蛋口在相应分子量大小处有明显的特异结合条带出现，从图中可 以看出虽然制备的为多克隆抗体，但抗体仍有较高的特异性。 pGEX拟4T拟1空载体菌在血约26 000处只有不太清晰的条带，说明 产生的兔抗GST拟P 6LBD血清中主要是B 6LBD蛋口的特异性抗体（图 4）o 3讨论 口蹄疫病毒宿主广泛，可感染牛、猪、羊、骆驼和鹿等动物, 特异性受体是其感染宿主细胞的先决条件。2000年，Jackson等证实 a v B 6整联蛋白是FMDV的细胞受体，随后Jeremy等发现整联蛋白a vB6在反刍动物主要分布于口腔、呼吸道、胃肠道、肾、汗腺、 蹄冠等组织的上皮

21、细胞6。目前对于a v36整联蛋白在猪体内的分 布还未见报道，因此寻找合适高效的表达方法获得目的蛋口，进行全 而系统的研究将有助于进一步揭示整联蛋白a vf36在FMDV感染中的 作用机制。本研究中我们选用原核表达载体PGEX拟4T拟1,成功表达 了口蹄疫病毒受体猪源整联蛋0 36亚基配体结合域，并制备了高效 特异的多克隆抗体。尽管重组蛋口的高水平表达取决于许多因素，包 括载体、宿主菌的培养条件和生长特性、cDNA、mRNA的结构和生 物学活性、目的蛋白生产中的调节作用等，但我们借鉴前人经验7, 8,实现了 GST拟B6LBD融合蛋白的高水平表达。由于pGEX表达载 体是谷胱甘肽转移酶（GST

22、）表达载体系列，该表达载体是专为外源多 肽能在大肠杆菌中表达，并可在非变性的条件下快速纯化而设计的， 其表达的外源多肽与Mr约为26 000的GST的C末端融合而形成融合 蛋白，一般以包涵体和可溶性两种形式表达。以包涵体的形式表达的 蛋口中，除含有目的蛋白外，还具有宿主菌的其他成分，难以纯化。 木试验采用Novagen公司的蛋口质纯化试剂盒，但纯化效果不明显， 杂带较多，可能是包涵体洗涤不彻底或超生裂解不充分所造成的，但 经进一步切胶纯化】9, 10,获得了更高纯度的目的蛋白，有利于制 备高纯度的抗体。 本实验中我们首选新西兰口兔作为制备抗体的动物，其价格低 廉、采血容易，并且可反复采血。对于

23、GST拟P6LBD融合蛋白，由于 其相对分子质量较大，免疫原性更强，更容易获得抗体，并且GST来 源于日本血吸虫，在真核生物中没有表达，而我们制备的抗体适用于 检测FMDV宿主组织中或重建细胞中B 6蛋口的表达情况，GST抗体在 其中应该没有交叉反应，所以本实验中并未切除GST部分，另外对抗 体进行的鉴定也证明了其中抗GST的部分很少。在GST拟P6LBD免疫 新西兰白兔3次后，抗体效价达1 ： 12 800,用硫酸钱盐对制备的抗 体进行纯化，获得了猪源整联蛋白B6亚基配体结合域的多克隆抗体, 从而为口蹄疫受体猪源a vP6整联蛋白的研究，如组织分布、细胞 受体封闭以及应用受体进行口蹄疫病毒检

24、测等奠定了基础。 【参考文献】 1 Jackson T, Mould AP, Sheppard D, et al. Integrin a v P 1 is a receptot for foot拟and拟mouth disease virus j . J Virol, 2002, 76(3): 935-941. 2 Jackson T, Clark S, Berryman S, et al. Integrin a v B 8 functions as a receptor for foot拟and拟mouth disease virus: role of the B 拟chain cytodomain in integrinjmediated infection j . J V让ol, 2004, 78 (9): 4533-4540. 3 Berryman S, Clark S, Monaghan P, et al.