伴生豇豆病毒科病毒和南芥菜花叶病毒RT PCR检测方法研究

1、伴生豇豆病毒科病毒和南芥菜花叶病毒RT-PCR佥测方法研究 伴生豇豆病毒科 (Secoviridae) 病毒共含有 66 个确定种和 3 个暂定种 , 具有 重要的经济重要性 ,其中 10种病毒被我国列为禁止进境的检疫性有害生物。 本研 究应用简并PCF技术,建立伴生豇豆病毒科病毒的半巢式 RT-PCF检测方法和豇豆 花叶病毒属病毒的RT-PCF检测方法;对现有南芥菜花叶病毒的RT-PCF方法进行 评价,并建立了一个新的RT-PCF检测方法和SYBRGreen I实时荧光定量PCF检 测方法；利用RT-PCF方法扩增了南芥菜花叶病毒的cp基因序列并进行遗传多样 性分析。 根据RNA1复制酶保守

2、区域设计简并引物,并筛选出3条简并引物,建立了伴 生豇豆病毒科的半巢式RT-PCR检测方法。该方法成功用于扩增20种伴生豇豆病 毒科病毒的 27 个分离物 , 包括 9 种豇豆花叶病毒属病毒、 2 种蚕豆病毒属病毒和 9 种线虫传多面体病毒属病毒。 通过在简并引物的5端引入测序引物,成功进行PCR产物的直接测序,并且 不会影响其通用性。利用该方法,首次测定了 BLMoV和BBSE分RdRp基因序列。 根据该保守区域进行系统发育分析 , 结果表明该系统发育关系与现有的分类 状况高度吻合 , 且测定的病毒分离物均可以与相应病毒种类具有最近的亲缘关系。 该方法具有良好的特异性 ,从寄主植物中未扩增出

3、预期大小的条带。 利用该方法 ,在来自田间的太子参中检测到蚕豆萎蔫病毒 2号。根据 RNA2 的外壳蛋白基因保守区域设计简并引物,建立了豇豆花叶病毒属的RT-PCF检测 方法。 该方法成功用于扩增 7种豇豆花叶病毒属病毒 10个分离物,而不能从其他豇 豆花叶病毒亚科病毒和健康寄主植物中扩增到预期大小条带 , 显示出良好的通用 性和特异性。通过在简并引物的 5端引入测序引物 (ComoV-2-F2-M4/ComoV-2-R1-M1)成功进行PCF产物的直接测序,并且不会影响 其通用性。 通过按1:10比例在PCR扩增中同时加入两对引物 (ComoV-2-F2-M4/ComoV-2-R1-M和M4

4、/M1),结果表明其灵敏度可以提高 1000倍。 另外，在简并引物的5端引入富含AT的非互补序列，在并未改变其通用性情况 下, 其灵敏度可以提高 100倍。 通过序列测定分析,除了 CPSMV(PV-0050)所扩增的病毒分离物均与相应的 病毒序列具有最高的序列同源性。通过对已报道的 6 个检测南芥菜花叶病毒的 RT-PCF方法(包含1个新建立的方法)进行理论和实际检测应用方面评价分析。 理论分析表明,在Tm值上,ArMV-370-F/ArMV-370-R引物对的温度差超过5C , 其它引物对均相对一致；在序列一致性上,引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R和 引物ArMV-36

5、4-R与已知序列具有最高的序列一致性。对来自水仙、百合、郁金 香等不同寄主上的 25个南芥菜花叶病毒阳性样品进行检测 ,结果表明 ,基于引物 对 ArMV-2-350F/ArMV-2-350R 和引物对 ArMV-364-F/ArMV-364-R 的 RT-PCR 方法均可以从 25个阳性样品中扩增到相应大小的条带 ,具有很好的通用性 ；而其 它引物对的方法则不能够完全扩增到相应大小的条带。 特异性分析表明,基于引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R的RT-PC肪法在同 属于豇豆花叶病毒亚科的其他病毒阳性样品和健康的寄主植物中未扩增到与 ArMV阳性样品大小相一致的条带。灵敏度比

6、较表明,基于引物对 ArMV-2-350F/ArMV-2-350R 的 RT-PCF方法和引物对 ArMV-364-F/ArMV-364-R 的 RT-PCF方法,其灵敏度相当。 因此，新建立的基于引物对 ArMV-2-350F/ArMV-2-350R的RT-PCRT法和已报 道的引物对ArMV-364-F/ArMV-364-R的RT-PCF方法具有良好的通用性、特异性 和灵敏性 , 能够满足日常检测的需要。通过对 2011-2013 年来自荷兰的水仙、百 合、郁金香种球上的21个ArMV分离物进行RT-PCRT增和序列测定,成功获得完 整的cp基因序列（1515 bp）。 序列分析表明,21

7、个ArMV分离物之间的cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性 分别为85.8%99.9%和92.1%100.0%,与已报道的蜂斗菜分离物同源性分别为 71.6%73.1%（核苷酸）和75.9%78.3%（氨基酸）,而与已报道其它分离物的氨 基酸序列同源性均在 89.7%99.2%。系统发育分析表明 , 不同分离物间可形成 3 个类群,蜂斗菜分离物单独形成一个类群m ,而其他分离物均在其他2个类群中。 其中,本研究所研究的12个水仙分离物属于I群，而8个百合和郁金香分离 物则属于n群。因此，即使来自同一国家的ArMV分离物,也可显示出很丰富的遗 传多样性。 根据cp基因保守区域设计引物,建立了南芥菜花叶病毒SYBRGreen I实时 荧光RT-PCR检测方法。所建立的方法其标准曲线相关系数为0.9972,扩增效率 达到 87.2%,且具有良好重现性。 灵敏度检测显示，该方法可检测到1.0 X 102 copies/卩L1.OX 101 copies/卩L的模板,，比普通RT-PCR方法提高10100倍。特异性分析显示, 具有良好的特异性。 利用所建立的方法 , 对百合、水仙、郁金香等病毒分离物进行