分子医学技能-免疫：淋巴细胞的分离、计数

1、淋巴细胞的分离、计数淋巴细胞的分离、计数 实验目的和要求实验目的和要求 l 掌握 外周血单个核细胞分离的方法外周血单个核细胞分离的方法 l 掌握 细胞计数的方法细胞计数的方法 实验原理实验原理 外周血中细胞种类外周血中细胞种类 细胞细胞密度密度 红细胞和多形核白细胞 1.092 淋巴细胞和单核细胞淋巴细胞和单核细胞（PBMC） 1.075 血小板 1.030-1.035 葡聚糖葡聚糖泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法 1.077 1.077 ： 根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的 细胞呈梯度分布，从而分离出PBMC。 实验材料实验材料 1. 肝素抗凝血肝素抗凝血 2. Han

2、ks液液 3. 淋巴细胞分离液（淋巴细胞分离液（F-H) 4. 水平离心机，加样枪水平离心机，加样枪 5. 显微镜，吸管显微镜，吸管 6. 细胞计数板，台盼蓝计数液细胞计数板，台盼蓝计数液 实验方案实验方案 抽取外周血抽取外周血 分离分离单个核细胞（淋巴细胞单个核细胞（淋巴细胞 和单核细胞）（和单核细胞）（PBMC） 细胞计数细胞计数 用Hanks液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合 取10ul于细胞计数板上 细胞计数 实验步骤实验步骤 肝素抗凝静脉血1.5ml 加加1.5ml Hanks液稀释液稀释 置于2ml淋巴细胞分离液上 ( (交界液面：一定交界液面

3、：一定不要打乱不要打乱) ) 稀释后的稀释后的 抗凝血抗凝血 淋巴细胞淋巴细胞 分离液分离液 注意注意：稀释的肝素抗凝血，：稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻沿管壁轻 轻叠加于轻叠加于分离液上，使两者形成一个分离液上，使两者形成一个 清晰地界面。清晰地界面。 肝素抗凝静脉血肝素抗凝静脉血1.1.5ml5ml 加加1.5ml Hanks液稀释液稀释 置于置于2ml淋巴细胞分离液上淋巴细胞分离液上 加样枪加加样枪加Hanks 液液 沿管壁轻轻叠加于沿管壁轻轻叠加于分离液上分离液上 吸管轻轻混匀后，吸取静脉血稀释液吸管轻轻混匀后，吸取静脉血稀释液 分离液管倾斜分离液管倾斜30-45度度 加完后，将管慢慢竖立

4、，加完后，将管慢慢竖立， 能看到明显分层能看到明显分层 用Hanks液洗、离 心 (1000rpm，5min) 重复2次 血浆血浆 分层液分层液 红细胞红细胞 粒细胞粒细胞 离心（2000rpm，25min） 淋巴细胞与淋巴细胞与 单核细胞层单核细胞层 注意注意：细胞经离心分层：细胞经离心分层 后，缓慢小心吸取，后，缓慢小心吸取，勿勿 打破形成的细胞层打破形成的细胞层。 取一支新吸管，伸到液面下取一支新吸管，伸到液面下 淋巴细胞层，吸取细胞淋巴细胞层，吸取细胞 把吸取的淋巴细胞把吸取的淋巴细胞 转移至新的离心管转移至新的离心管 加入加入Hanks 液，补到液，补到 10ml，可以直接倾倒，可以

5、直接倾倒 离心离心 第一次洗涤 第二次洗涤 吸管吸掉上清，注意不要吸掉吸管吸掉上清，注意不要吸掉 底层的细胞，可残留部分液体底层的细胞，可残留部分液体 所要的细胞在底部所要的细胞在底部 用量程用量程200ul的加样枪的加样枪 轻轻混匀，重悬细胞轻轻混匀，重悬细胞 加入加入Hanks 液，补到液，补到 10ml，可以直接倾倒，可以直接倾倒 台盼蓝稀释（1:1） 吸管吸掉上清，注意吸管吸掉上清，注意 不要吸掉底层的细胞，不要吸掉底层的细胞， 残留部分液体，估计残留部分液体，估计100ul （离心管最底的刻度）（离心管最底的刻度） 用量程用量程200ul的加样枪的加样枪 轻轻混匀，重悬细胞轻轻混匀，

6、重悬细胞 新的新的EP管，分别加入管，分别加入10ul 细胞悬液和细胞悬液和10ul台盼蓝，台盼蓝， 用量程用量程10ul的加样枪混匀，的加样枪混匀， 吸取吸取10ul加到计数板上加到计数板上 细胞悬液细胞悬液台盼蓝台盼蓝 先加盖玻片，细胞稀释液滴在计数池边缘（盖玻片边缘） 细胞计数板 细胞计数 原则：原则： 数上不数下，数左不数右数上不数下，数左不数右 长长1mm宽宽1mm 结果计算结果计算 2 2个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/ml) 10104 410 = =(稀释倍数稀释倍数） 活细胞百分率 = = 活细胞数 细胞总数 100% 细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色） 细胞数量： 方法评价方法评价 u 纯度在90%以上 u 淋巴细胞约占90-95% u 细胞收获率可达80-90% u 活细胞百分率在95%以上 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞： 细胞计数的仪器 血细胞分析仪，临床常用血细胞分析仪，临床常用 装有自动显微镜观察系统装有自动显微镜观察系统 自动细胞计数仪自动细胞计数仪 注意事项注意事项 l 请将请将带血带血的试管，吸管收集放置于实验室后的的试管，吸管收