发酵法生产维生素c

1、发酵工艺学课程论文题目名称：发酵法生产维生素C姓名：张晓伟所在学院：食品学院电话师：陈玉刚导师所在单位:石河子大学食品学院 专业：食品加工与安全发酵法生产维生素 C摘要：维生素C又称L-抗坏血酸是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。抗坏血酸在大多的生物体可借由新陈代谢制造出来， 但是人类是最显著的例外。 最广为人知的是缺 乏维生素 C 会造成 坏血病。在生物体内，维生素 C 是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的 威胁，维生素 C 同时也是一 种辅酶。其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。维生素 C 为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯， Vc 主要来源新鲜水果和蔬菜，

2、是高等灵长类动物与其他 少数生物的 必需营养素。 Vc有L-型和D-型两种异构体，只有 L-型的才具有生理功能，还原 型和氧化型都有生理活性。 其结构是一种含有 6 个碳原子的酸性多羟基化合物， 分子式为 C6H8O6 分子量为 176.1 。天 然存在的抗坏血酸有 L型和D型2种，后者无生物活性。维生 素C是呈无色无臭的片状晶体，易溶于水，不溶于有机溶剂。 在酸性环境中稳定， 遇空气中 氧、热、光、碱性物质，特别是由氧化酶及痕 量铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破 坏。氧化酶一般在蔬菜中含量较多， 故蔬菜储存过程中 都有不同程度流失。 但在某些果实中 含有的生物类黄酮，能保护其稳定性。维

3、生素 C 是生命的必需营 养元素 , 具有多种生理功 能, 因而改进维生素 C 生产工艺、 提高产品产量和质量成为目前维生素 C 研究的热点。 目 前, 国内维生素 C 最主要的生产方式是二步发酵法。 本文对维生素 C 二步发酵法的 生产过 程及目前对这一生产工艺改进的主要技术措施和研究方向作一介绍 关键词：维生素 C 生产工艺 二步发酵法 主要技术前言维生素 C 是简单结构的有机化合物 , 与单糖有密切关系。研究表明植物中含有抗坏血酸 氧化酶， 能催化维生素 C 氧化，维生素 C 广泛分布在植物组织中 , 新鲜水果及蔬菜中含量 尤多。多数哺乳类 和禽类也都能由葡萄糖合成足够数量的 L- 抗坏

4、血酸。 但人、 豚鼠、 猴子、 蝙蝠、某些爬行动物及大多数人工养殖的鱼类甲壳类体内缺乏古洛糖酸内酯氧化酶 , 不能将 古洛糖酸 内酯转化成 L- 抗坏血酸， 不能生物合成维生素 C, 动物体内贮藏维生素 C 量不大， 它们必须经常从 环境或食物中摄取维生素 C 补充。维生素 C 广泛存在于新鲜水果及绿叶蔬 菜中，尤以猕猴桃、板栗 （生） 、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量丰富。中草药如醋柳果、 苍耳子等也含有很多维生素 C 。维生素 C 纯品为白色单斜晶系的结晶或结晶性粉末，无臭味酸，久置色微黄。易溶于 水，略溶于 乙醇，不溶于乙醚、氯仿。它是一种不饱和的多羟基六碳化合物，以内酯形式存 在，在 2

5、 ，3 位碳原 子之间烯醇式羟基上的氢可游离出来，故具有酸性。维生素 C 具有很 强的还原性，故极不稳定，容易为热或氧化剂所氧化，在中性或碱性溶液中尤甚；光、微量 重金属（特 别是 Fe2+ 、Cu2+ ）或荧光物质（如核黄素）更能促进其被氧化。微量金属元素对维生素 C 的氧化分解的催化作用，以铜离子为甚，其顺序为 Cu2+ Co2+ Mn2+ Zn2+ Fe2+ 。在低于 p H5.5 的溶液中，维生素 C 较为稳定；所以提取维生素 C 时，草酸和偏 磷酸是较好 的稳定剂维生素C的发酵是指通过发酵作用将原料转化为维生素C,再通过生物分离技术将其从发酵液中分离提纯，获取满足要求的维生素C 产品

6、。维生素 C 的发酵过程中包含菌种的培育、 菌种的保藏、 种子的制备、 发酵动力学、 发酵环节的控制和染菌及防治六个方面。概括地说，在发酵的整个过程中要选育出优秀的发酵菌种并采取合理有效的方法予以保藏，保持其优良性状； 在实际生产时要对菌种进行扩大培养， 满足生产上对发酵菌的数量要求；对于发酵还应全面的考虑发酵的消耗、 产率问题， 并通过适当的控制方法提高效率； 染菌和污染是发酵 过程中 的一个非常严重的问题， 需要严格控制， 频繁检测确保发酵罐安全， 避免或较小损失。 v C 自四十 年代开始工业化生产 ，其生产技术是德国人 R eichstdn 于 1933 年发明的 （简称莱 氏珠）,

7、即以 0 一 山梨醇为原料 ,经过醋酸菌发酵生成山梨糖 ,再经过酮化、 化学氧化 和水解 得 到 2 一酮基一 L 一古 龙酸 ， 再经化学转化得到 v C. 其工艺比较复杂 ， 而且消耗大量苯、丙 砚和发烟硫酸等易燃易爆和 有毒原料，此法至今仍被延用。维生素C 是生命的必需营养元素， 具有多种生理功能 ， 随着维生素 C 实验应用范围的增加 ， 市场需求量日益增大 ， 人们 对维 生素 C 实验生产技术不断进行研究改进。维生素 C 实验的生产技术经历了浓缩提取、 化学合成和生物 发酵三个阶段。以前， 维生素 C 实验是从柠檬、 辣椒等天然植物中提取的 ，价格昂贵且生产量低 ， 远不能满足市场

8、需求 ， 现已退出工业生产。化学合成法主要是莱氏法， 该法工艺路线成熟 ， 原料简单易得 ， 产品质量好收率高 ， 但此法工艺路线长 ， 难以连续 化操 作 ， 且需耗费大量有毒、易燃易爆的化学药品 ， 既危险又污染环境。微生物二步发酵法 具有工艺路 线短、 “三废”少、原料单耗低和对设备腐蚀性小等优点。本文就微生物二步发酵法合成维生素 C 实验的生产工艺改进过程及新的研究方向作介绍。1 Vc 的性质、功能和用途1.1 性质 纯 Vc 在常温下为无色晶体 ， 味酸 ， 易溶于水。 Vc 在结晶状态尚稳定 ， 而在水溶液中则很不稳 定,容易为加热、氧化所破坏。L抗坏血酸具有较强的还原性 ，在体内

9、经抗坏血酸氧化酶的作 用可脱 氢氧化成L脱氢抗坏血酸，该脱氢反应是一个可逆反应。还原型的L抗坏血酸和氧化 型的L脱氢抗坏血酸均具有生理活性 ，它们构成的一对氧化 -还原系统 ，在细胞代谢中起着 重要的生理作用。1.2 功能与用途Vc 在人体中具有广泛的生理作用 :1参与体内氧化还原反应 ;2 对抗自由基损伤 ;3 改善机体免疫功能；4参与胶原蛋白和细胞间质的合成;5参与神经递质的合成;6参与氨基酸代谢与 铁代谢；7抑制血小板及白细胞活化；等等。因此，Vc在坏血病、感冒、心血管缺陷、高胆固醇、糖尿病、精神抑郁症、危重型克山病等疾病的临床治疗中均具有重要的用途。此外,Vc还可以用作食品添加剂、饲料

10、添加剂、某些农作物的催熟剂、化妆品工业防锈剂，等等。2 Vc的生产技术2.1 生产工艺方法的演变过程2.1.1浓缩提取本世纪的二、三十年代，人们对于维生素C的结构、性质还不了解，获取其产品的途径只是经验性地由富含“还原性因子”的生物组织如柠檬、胡桃、野蔷薇、辣椒、肾上腺等远远不能满足人类社会日益增长的物质需求。C。直至提取获得。 此法生产成本高，产量有限， 五十年代，仍有企业使用此法生产维生素2.1.2 化学合成1933 年， Reichstein 等和 Ault等两个研究小组分别独立发表了维生素法。从1937年开始，以 Reichstein和Grussner的发明为基础，建立了以C的合成方D

11、-葡萄糖为原料，加氢还原成 D-山梨醇， 然后利用一步发酵方法和化学方法合成维生素C的“莱氏法”Reichstein Procedure )，维生素C生产开始进入化学合成阶段。“莱氏法”生产的工艺流程主要包括以下五个步骤：1) D-葡萄糖在镍的催化作用下，高温高压，加氢还原成D-山梨醇；2) D-山梨醇经微生物如生黑葡萄糖酸 杆菌(Gluconobacter melanogenus )或弱氧化醋酸杆菌(Acetobater suboxydans )发酵氧化成 L-山梨糖；3) L-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下，经酮化生成双丙酮-L-山梨糖(Diacetone-L-sorbose 简称双酮糖)，生

12、产上俗称丙酸化。再用苯或甲苯提取，提取液经水法除去单酮山梨糖后，蒸去溶剂而后分离出双酮糖；4) 双酮糖在高锰酸钠氧化，铂催化下，经水解生成2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-gulonic acid)；5) 2-酮基-L-古龙酸通过烯醇化和内酯化，在酸性或碱性条件下，转化生 成维生素C。莱氏法生产的Vc产品质量好、收率高，而且生产原料(葡萄糖)便宜易得，中间产物(如双 丙酮 _L_山梨糖)化学性质稳定，但是莱氏法也存在着不少缺陷 ，诸如生产工序繁多、劳动强度 较大，容 易造成环境污染，等等。为此，自上世纪60年代起，各国学者一直致力于莱氏法的改 进7,20,并 取得了很多成果，有的已用于V

13、c工业生产实践。2.1.3微生物发酵法六十年代以后，各国生产企业及科学家开始探索以细菌生物酶转化的方法来取代“莱氏法”，相继提出了诸多反应路线，并在此基础上对有关反应工艺的问题进行了探索。已成功应用于大生产的细菌发酵法是我国七十年代初开发的“二步发酵法”。由中国科学院微生物研究所、北京制药厂、东北制药总厂尹光琳、宁文珠等人发明的“二步发酵法”从七十年代后期开始正式投产，逐渐在国内生产企业普遍采用，现在国内四大维生素C生产企业都采用此法。二步发酵法生产维生素 C的新工艺1980年获得国家级二等奖。“二步发酵法”已 经在中国、欧洲、日本和美国申请了专利，上海三维制药有限公司当时具有坚实的科研开发力

14、量，1985年成功地将维生素 C二步发酵技术转让给F Hoffmann-la Roche Ltd. ， Switzorland(瑞士豪大迈-罗氏公司)，成为建国以来最大的一项医药技术出口项目。该法应用于大生产初时，从 D-山梨醇到维生素C的总收率平均为百分之四十多，但经过近几年的激烈市场竞争后，一些厂家可超过百分之六十五，最高为72%。“二步发酵法”的工 艺路线与“莱氏法”不同之处在于采用大、 小混合菌发酵法代替化学法转化 L- 山梨糖合成 2- 酮基 -L- 古龙酸。简化了生产工艺，减少了生产设备投资，降低生产成本，去除了大量有机 溶媒等有毒物品的使 用，极大地减少了“三废”的排放。2.2

15、微生物发酵法的研究进展严格地讲 , 二步发酵法也是一种半微生物发酵半化学合成方法。该工艺方法的发酵原料 仍为 D- 山 梨醇,而非葡萄糖 ；并且，第二步发酵过程中涉及 2 株菌的混合发酵 ，其详细消长机 制尚未完全明 了。这些都需要人们进一步研究和探索。2.2.1 二步发酵法“二步发酵法” 是唯一应用于大生产化的细菌发酵途径。 采用生物技术进行发酵生成维 生素 C 的重要中间体2-酮基-L-古龙酸的工艺，使我国二步发酵法处于世界领先水平。目前，通过细胞固定化，原生质融合， 遗传工程等新技术的使用，如中国科学院等离子体物理 研究所采用离子束注入技术 作为新诱变源筛选出 2- 酮基 -L- 古龙酸

16、高产菌系 IPPM-1028 、中 国科学院沈阳应用生态研究所的新 型微生物蛭弧菌J26转化山梨糖生产 2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究，使“二步发酵法”工艺研究更加具有国际先进水平。“二步发酵法”经过的是 L 一山梨糖途径 ，即 D 一葡萄糖加氢生成的 D 一山梨醇先经细菌转化为 L 一山梨糖 ，后者 再经 过细菌发酵生成维生素C 前体一 2 一酮基一 L 一古龙酸 (2 一 keto L 一 gulonie aeid,ZKLG) 。这两步反应是在不同微生物一t 进行的。2.2.1.1 大、小菌的相互关系二步发酵法的第二步发酵是采用大菌、小菌 2 株菌的混合发酵过程 ，2 株菌缺一不可。

17、Vc 工业 生产中常采用的小菌为氧化葡萄糖酸杆菌，大菌为巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或条纹假单孢杆菌。研究发现 ， 在大、小菌的混合培养中 ， 两者的增殖是同步进行的。小菌是 2- KLG 合成的主体 ， 大 菌一方面直接参与 2- KLG 的合成过程 ， 一方面对小菌的生长起促进作用6 。小菌合成的 2- KLG对大菌的生长增殖有明显的抑制作用，而大菌的存在却是小菌的 生长增殖和合成 2- KLG 所必需的12。深入研究发现 ，大菌的胞内液和胞外液均可促进小菌的生长 ，大菌胞外液中具有该作用的组分的分子量在100kD 以上。此外 ,胞外液还具有促进小菌转化I-山梨糖生成2- KLG的作用，具有

18、该作用的组分包括30- 50kD和大于100kD两部分，其中前者系一种含铁和锌的蛋白质 13 。目前， 这方面研究仍在继续。2.2.1.2 新菌种的选育优良的菌种对于 Vc 产量和经济效益的提高具有特殊重要意义。焦鹏等 (1997)14 运用 SMA 探针 技术与 HB- HG 影印技术筛选得到了一株蛭弧菌J26, 摇瓶发酵产生 2- KLG 的发酵单位为 50- 60mg/ml 。通过优化发酵条件 ，该菌株的发酵单位已达到83.9- 91.7%15 。许安等(1998)16 利用离子注入技术选育出的2- KLG 高产菌系 IPPM- 1028 的山梨糖转化率比由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌

19、组成的出发菌系高出18.8%。摇瓶发酵试验表明 ，该菌系的发酵周期为 60_64h ，2_KLG 浓度可达 76g/L17 。陈建华等 (2002)18 筛选得到的优良伴生 菌 短小 芽孢杆菌 ( Bacillus pumilus) 与氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵生产2_KLG 的山梨糖转化率高达 90%尹光琳等 (1997)19 选育得到的新组合菌系 SCB329_SCB933 勺发酵周期 仅为 40_50h,2_KLG 的发酵单位高达 115- 130mg/ml 。2.2.1.3 工程菌的构建为了克服传统二步发酵法的缺点，人们开始尝试构建优良的产2- KLG 工程菌。工程菌的构建主要建立在人们

20、对二步发酵法菌种相关关键酶的研究基础之上。1974年,Markover等提出了微生物合成 2-KLG的山梨酮途径学说，认为L-山梨糖在微生 物体内先由L-山梨糖脱氢酶(SDH)催化生成I-山梨酮，尔后再由L-山梨酮脱氢酶(SNDH)催化 生成2- KLG后来，人们从氧化葡萄糖酸杆菌、 生黑葡萄糖酸杆菌等中陆续分离纯化出了 SDH 研究发现，SDH的分子量为46- 60kD,系一个典型的米氏酶,对L-山梨糖的Km值为5.27 X 102 mol/L 0 SDH 的活力与 2- KLG 的合成呈正相关 ，伴生菌的存在能提高 SDH 的比活力。 Shinjoh 等(1994) 首先从液化醋杆菌中克隆

21、了SDH 基因和 SNDH 基因。关于 SDH SNDH 及其编码基因的研究为构建优良的产 2- KLG工程菌奠定了基础。1998年,Saito等将SDH基因和SNDH基因导入氧 化葡萄糖酸杆菌 , 结果发现 , 转化菌株的 2- KLG 产量比出发菌株有较大提高。这方 面研究尚待继续 深入。2.2.2 葡萄糖直接发酵法国外较早就开始了细菌串联发酵葡萄糖产生 2- KLG 的研究。我国的尹光琳等 (1987) 采 用欧文氏 菌和棒杆菌以葡萄糖为发酵原料串联发酵产生2- KLG 获得成功。后来 ,她们又通过原生质体融合技术得到了欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞。摇瓶发酵试验表明, 细胞融合所得的 38

22、 株融合子中约有 40%能将葡萄糖转化成 2_KLG 氧化葡萄糖酸杆菌与棒杆菌的休止细胞 共固定化 串联发酵葡萄糖产生 2- KLG 工艺的最高转化率达到 37.72% 。1985年,Anderson等将棒杆菌的2,5-酮-D-葡萄糖酸(2,5- DKG)还原酶基因转入欧文氏菌 ,所得工程菌的葡萄糖转化率可达到47.7% 。后来 ,又有一些学者进行了类似试验,并取 得初步成果。但是他们所获得的工程菌都存在着一定的问题 , 因此至今未见到用于生产实践 的报道。2.2.3 2- KLG 的分离提纯二步发酵法两次发酵以后 , 发酵液中仅含 8%左右的 2- KLG, 而残留菌丝体、蛋白质、多 糖或悬

23、 浮微粒等杂质的含量却很高。这给 2- KLG 的分离提纯带来了很大困难 ，致使后处理费用占总成本的比例较大。目前 ,Vc 工业生产中常用的 2-KLG 的分离提纯方法有 :1 加热沉淀 法;2 化学 凝聚法 ;3 超滤法。2.2.3.2 化学凝聚法同加热沉淀法相比 , 化学凝聚法采用化学絮凝剂沉淀各种杂质 , 从而避免了前者能耗较 多的问 题。季光辉等 (1997) 研制的新型化学絮凝剂能使 Vc 的总收率提高 2.5%。张秋荣等 (1999) 通过摸索 絮凝处理的最佳条件， 使 2-KLG 的提取收率比加热沉淀法高出 4.49%。但是发酵液经化学絮凝剂处理以后,离心所得的上清液中仍含有一定

24、量的蛋白质等杂质,这些杂 质可能影响2- KLG 的质量。此外 ,该方法所使用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。2.2.3.3 超滤法超滤法是一种新兴的膜处理技术。由于该方法在提高 2- KLG 收率、改善生产环境、减 少离子交 换树脂损耗、实现自动化连续化生产等方面具有明显优势，因此在 2- KLG 分离提纯中的应用日益广泛。 1995 年,我国的东北制药厂从丹麦引进了目前全国最大膜面积的平板超 滤装置。采用这套设备后 ,2- KLG 的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了 600 万元 ,并 且大大提高 了 2- KLG 的收率和生产的自动化、连续化程度 34 。但是超滤法也具有一定的 缺

25、陷。 例如 ,设备一 次性投资较大 ,超滤装置的通量、 抗污染能力尚待提高,等等。 目前 ,国内 外学者正在探索反渗透、纳滤等新的超滤法工艺。2.2.4 2- KLG 的化学转化由于至今未能找到使葡萄糖直接发酵产生 Vc 的微生物菌种 , 因此发酵产生的重要中间 产物 2- KLG必须通过化学方法转化成Vc。根据所用化学试剂不同将化学转化方法分为酸转化法和碱转化法。 由于前者所用的浓盐酸对设备腐蚀较严重 , 且易造成环境污染 , 因此逐渐为 后者所 取代。碱转化法的2- KLG 转化率可达到 92.6%, 并且操作简便 ， 对设备的腐蚀较轻 ， 所以适于 Vc 的规模化生产。2.2.5 2-

26、KLG 废液处理二步发酵法发酵液经分离提纯后 , 仍含有大量的 2- KLG 。如果将其直接排放 , 不仅浪费 了宝贵 的 2- KLG 资源,而且会对环境造成严重污染。王辉等 (1998)运用离子交换树脂处理废液,可大大降低其中的杂质 (如色素 )含量,从而从废液中再结晶出 2- KLG 合格产品。王燕等 (1999) 则对利用 2- KLG 废液生产草酸进行了小试和中试。3 结语目前，维生素 C 混合生产菌的基础研究中，由于二步发酵混合大小菌株的作用关系还 没有较科学 论证，混合菌发酵L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸的机制只有宏观的研究，在工业化生产中， 糖酸转化率受培养外界环境因子的影

27、响很不稳定， 因其内在微妙机制还没有 研究成 果， 这给稳定单罐糖酸转化率的高水平带来困难。 外界环境因子的进一步优化组合技 术对工业化生产 的进一步发展显得尤其重要。Vc用途广泛，是我国医药出口创汇的最重要产品之一。大力提高 Vc 的生产技术水平 ，提高 Vc 产品的产量与质量 ，降低生产成本 ，不仅有利 于我 国 Vc 生产工业的发展 ，而且对整个国民经济都具有积极的作用。从技术上讲，根据目前国内外 Vc 工业生产的现状 ，我国应注重以下几个关键问题：3.1 利用基因工程等先进手段选育优良的微生物菌种二步发酵法是我国 Vc 工业生产的当家工艺方法。然而，该方法涉及二步三种菌 ，操作工序繁琐

28、 ， 菌种传代困难 ， 不能直接把葡萄糖作为发酵原料。 如果能选育出直接以葡萄糖为发酵 原 料的优良菌株并应用于生产实践 ，那么无疑会对 Vc 生产工业带来巨大的推动力。理论分析 和初步实验 证明 ， 上述设想是切实可行的。 在长期的菌种选育实践中 ， 基因工程这一新兴技术 显示出良好的 应用前景。今后 ， 应当广泛采用基因工程等先进手段 ， 争取早日选育出适于 Vc 工业生产的优良菌 种。由于“二步发酵法”的现有转化率己经达到相当高的水平，因此想继续提高 Vc 的生产效率应该筛选新的菌株 ，来简化现有的生产工艺。3.2 影响发酵工艺的因素微生物发酵是一个极为复杂的生化反应过程。 基质、 温度

29、、等因素对微生物的代谢以及 菌体生 长和产酸的形成都会产生影响。维生素“二步发酵法”是我国独特的生产工艺， 技术路线成熟，工人操作熟练，发酵产率和产品质量均己达到国际水平。但维生素C二步发酵法”过程十分复杂 ， 干扰因素多 ， 再加之生长自动化、连续化程度差 ， 因而造成生产稳定性不够 ， 劳动生户 ;率较低。此外由于发酵基质浓度低， 设备利用率差 ， 这就导致工厂的生产成本偏高。 为了解决以上问题 ， 对该发酵工艺动力学的研究是非常必要的。邵军等和魏东芝等分别于1989 年和1992 年报道了对维生素 c 二步发酵过程动力学的研究。 他们通过测定发酵体系中 大小菌生长规律 ， 以及基质和产酸的变化 ， 建立了简化的动力学模型 ， 不仅从一定程度上揭示 了 ZKLG 发酵系统的 本质特征 ，而且可用于分析发酵过程并指导生产。同时，动力学模型的建立也为维生素 C 二步发酵生产实现连续自动化奠定了理论基础。近年来国内部分科研单位和制药厂对于第二步发酵混合菌株