Stenotrophomonasmaltophilia角蛋白酶的分子改造

1、Stenotrophomonas maltophilia角蛋白酶的分子改造角蛋白酶(keratinase) 是一种可以特异性降解角蛋白底物的水解酶 , 在饲料、 洗涤、皮革以及医药行业有着巨大的潜在应用价值。 但目前角蛋白酶产量低和酶 学性质差 , 严重阻碍了角蛋白酶的商业化开发和工业化应用。为实现角蛋白酶工业化生产及应用 , 本研究筛选获得一株能高效降解羽毛废 弃物的嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1, 通过摇瓶 和发酵罐发酵水平的优化 ,提高角蛋白酶产量 , 并对酶进行纯化和酶学性质解析 ; 在此基础上 , 进一步鉴定角蛋白酶基因

2、, 构建其异源表达系统 ,通过理性改造提高 角蛋白酶性能。 主要研究成果如下 :(1) 角蛋白酶生产菌的筛选和发酵优化从无锡 市马山家禽养殖场筛选得到一株以羽毛作为唯一碳氮源的 S.maltophilia BBE11-1,在其发酵液中测得明显的角蛋白酶活力。在摇瓶水平上 , 通过单因素、 Plackett Burma及响应面分析等实验 , 确定发 酵培养基为 :1.5 g?L-1 天冬氨酸 ,1.45 g?L-1 大豆蛋白胨 ,4.25 g?L-1 葡萄糖 ,10 g?L-1 羊毛,1 g?L-1 K2HPO4,1 g?L-1 KH2PO4,1 g?L-1 Na Cl,100 l?L-1 吐温

3、 20,初始p H 9.0,23 C,200 rpm 摇床培养 48 h。在 3 L 罐中,采取多种发酵策 略( 温度转化策略、溶氧控制策略和葡萄糖流加策略 ),S.maltophilia 的角蛋白 酶活力由优化前的 145.2 U?ml-1 提高到 1282.7 U?ml-1, 发酵时间从 48小时缩 短到 18 小时。将上述发酵过程放大至 30 L罐,发酵 18小时角蛋白酶活力达到 1728 U?ml-1, 比摇瓶水平的生产力提高 32 倍。此外 , 发酵液中必需氨基酸含量较高 , 具有开发 有机肥料或者饲料添加剂的潜力。(2) 角蛋白酶分离纯化及性质解析 S.maltophilia 发酵

4、上清液依次经疏水柱、 离子交换柱及凝胶柱纯化 , 分离得到三种和角蛋白降解相关的蛋白 ,其中两种蛋 白具有角蛋白酶活性 , 分别命名为 Ker SMD和 Ker SMF。蛋白质 N端测序分析显 示,Ker SMD和 Ker SMF的 N端氨基酸序列分别为 LAPNDPYYQ和QLTPNDTRFS。E 基于 S.maltophilia 基因密码子偏好性 , 根据 N端氨基酸序列设计简并引物 , 采用热不对称 PCR方法筛选得到 S.maltophilia BBE11-1基因组中的角蛋白酶基 因 ker SMD(1905 bp) 和 ker SMF(1743 bp) 。以 p ET 质粒为载体 ,

5、 将上述角蛋白 酶基因表达于大肠杆菌 BL21(DE3), 在重组菌上清液中均检测到角蛋白酶活性。其中 Ker SMD的角蛋白酶活性是 Ker SMF的三倍;Ker SMD在 50?C半衰期 是Ker SMF的9倍,所以 Ker SMD更加稳定。 (3) 角蛋白酶 C端结构功能解析蛋白 酶的 C端结构往往和底物特异性相关 ,本研究还发现角蛋白酶 Ker SMD的 C端结 构具有自我剪切特性。为研究 C端结构对酶学性质的影响 , 以- 折叠的二级结构为单位对 C端进行 逐步缺失 ,分别得到突变体 V456,V455,V435,V415,V395,V380,V370 和 V355。发 现整个 C端

6、缺失的突变体 V355对胶原蛋白降解活性低 ,在强碱(p H12) 下表现出 40%的相对酶活 , 在高盐(15%,w/v) 环境下表现出 60%的相对酶活 , 以及在高浓度 (4%,w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)下表现出 48%的残余酶活 , 在洗涤剂和皮革加工 中具有较大应用潜力。V380、V370和 V355在 60?C下的角蛋白酶活性提高 1.7 倍; 其中 V456在 60C下保温 90 min 拥有将近 70%的酶活, 较野生酶提高 20%。模拟结构分析表 明,V456 的催化中心位点的空间距离和氢键数量都变少 , 可能增强了催化三联体 的相互作用力从而增加了该突变体的热稳定

7、和嗜热性 ;V355 催化三联体上端形 成的弱负电荷环状结构增强了催化活性中心与 SDS的静电斥力 , 可能是 SDS耐受力增强的重要原因上述结果表明 ,C 端结构可通过调节催化活性中心的作用力来影响 Ker SMD 底物特异性以及抗逆性能。 (4) 结构域重组提高角蛋白酶 Ker SMD催化活性及热 稳定性氨基酸序列比对和蛋白模拟结构分析显示 Ker SMD和 Ker SMF具有独立的 N端前导肽和 C端结构。采用 N/C端结构域重组的策略 , 构建并成功获得基于 Ker SMD催化区域的突 变体 DDF、FDD、FDF、DD和FD。与野生酶相比 ,DDF比酶活(角蛋白酶活性 )提高 500

8、多单位,达到 390945 U?mg-1,催化速率 kcat/Km 也增长 54.5%。FDF60C半衰期达到 244.6? ?2 min的,是野生型的 5.9 倍;此外,FDF在 p H 8.0-12.0 条件下的活性比野生酶提高了 12%,上述性质有助于 FDF在皮革以及 洗涤剂等行业的应用。 蛋白模拟结构显示新的结构域的引入主要改变了底物结合 口袋形态 , 说明角蛋白酶 C端结构可以调节底物结合口袋大小来影响角蛋白酶的 底物催化特性 ; 而 N端前导肽则是通过辅助蛋白折叠和加速成熟的特殊功能来实 现角蛋白酶的高催化活性和热稳定性。(5) 分子改造 S1口袋提高 Ker SMD催化活性根据

9、以上研究 ,发现 Ker SMD的 催化活性与底物结合口袋 S1 构象变化有关。晶体结构和氨基酸序列分析显示 ,S1 口袋中主要存在四个差异氨基酸 (Ser180 、Glu208、Tyr215 和Arg216), 对其疏水 性或者侧链短小氨基酸的定点突变 , 发现 Tyr215 位点对于 Ker SMD的催化活性影 响最大,其中 Y215G表现出最高催化速率 (365 s-1 m M-1)。然后对 Tyr215 位点进行饱和突变 , 发现合适的侧链空间体积和疏水性有助 于 Ker SMD催化活性的提升。为进一步优化 S1口袋构象 , 对三个位点Ser180,Glu208 和 Tyr215 进行组合突变 :S180G/Y215S表现出最高角蛋白酶活性 (4800 138 U?mg-1);突变体 S180G/Y215A的K:C比值(角蛋白比酶活 :酪蛋白比 酶活)为所有突变体中的最大值 ,将近 4.5。另外,还检测到 Y215S,Y215G和S180G/Y215S具有嗜热性 ,其中Y215S在70 C下角蛋白比酶活 (7000 U mg-1)比野生酶提高了 2倍。蛋白模拟结构显示 ,