第八章 蛋白质和氨基酸的测定[高等教学]

1、1高级教学 2高级教学 3高级教学 凯氏定氮法凯氏定氮法 杜马斯法杜马斯法 福林酚法福林酚法 染色法染色法 4高级教学 5高级教学 6高级教学 7高级教学 8高级教学 9高级教学 蛋白质含量蛋白质含量 换算系数换算系数 蛋或肉蛋或肉 16.0 6.25 牛牛 奶奶 15.7 6.38 小小 麦麦 18.76 5.33 玉玉 米米 17.70 5.56 燕燕 麦麦 18.66 5.36 大大 豆豆 18.12 5.52 大大 米米 19.34 5.17 10高级教学 11高级教学 12高级教学 13高级教学 14高级教学 15高级教学 16高级教学 17高级教学 18高级教学 19高级教学 20

2、高级教学 21高级教学 22高级教学 23高级教学 24高级教学 25高级教学 26高级教学 27高级教学 28高级教学 29高级教学 30高级教学 31高级教学 32高级教学 33高级教学 34高级教学 35高级教学 36高级教学 37高级教学 38高级教学 39高级教学 40高级教学 41高级教学 42高级教学 43高级教学 44高级教学 45高级教学 46高级教学 47高级教学 48高级教学 49高级教学 50高级教学 51高级教学 52高级教学 53高级教学 54高级教学 55高级教学 56高级教学 57高级教学 58高级教学 59高级教学 60高级教学 61高级教学 62高级教学 6

3、3高级教学 64高级教学 65高级教学 66高级教学 67高级教学 68高级教学 69高级教学 70高级教学 71高级教学 72高级教学 73高级教学 74高级教学 75高级教学 76高级教学 77高级教学 78高级教学 79高级教学 80高级教学 81高级教学 82高级教学 83高级教学 6.25 = 6.25 = 6.38 = 5.95 84高级教学 85高级教学 2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂作为催化剂、

4、消化终点指示剂 加氧化剂加氧化剂 加速有机物氧化速度加速有机物氧化速度 86高级教学 87高级教学 NH4+ + OH- = NH3 +H2O 88高级教学 89高级教学 用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿）溴甲基酚绿） 指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸） 吸收与滴定吸收与滴定 反应式为：反应式为： NHNH3 3+H+H3 3BOBO3 3=NH=NH4 4+ +H+H2 2BOBO3 3- - H H2 2BOBO3 3- -+H+H+ +=H=H

5、3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再 用用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。标准溶液滴定过剩的酸液。 90高级教学 量量NaOHNaOH 少少 91高级教学 1000W %100K)(C MVVN 21 92高级教学 NH2CONHCONH2 + NH3 NH2CONH2 + NH2CONH2 150160 双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性能和硫酸铜的碱性 溶液生成溶液生成紫色络和物紫色络和物。紫色络和物。紫色络和物。 93高级教学 操作方法操作方法 1 1、制作标准曲线、制作标准曲线 取取1010支干试管分成两组，按下表平行操作支干

6、试管分成两组，按下表平行操作 0 01 12 23 34 45 5 标准蛋白液标准蛋白液/ml/ml 0.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0 蛋白浓度蛋白浓度/(mg/ml)/(mg/ml) 2.02.04.04.06.06.08.08.010.010.0 蒸馏水蒸馏水/ml/ml1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20.00.0 双缩脲试剂双缩脲试剂/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0 A A540 取两组测定的取两组测定的A A540值的平均值，即值的平均值，即A A540 540为纵坐标，蛋白质

7、为纵坐标，蛋白质 浓度为横坐标，绘制标准曲线。浓度为横坐标，绘制标准曲线。 94高级教学 2 2、样品测定、样品测定 取取4 4支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作： 0 01 1 样品稀释液样品稀释液/ml/ml 0.50.5 蒸馏水蒸馏水/ml/ml1.01.00.50.5 双缩脲试剂双缩脲试剂/ml/ml4.04.04.04.0 A A540 95高级教学 %100(%) c NY 固体样品蛋白质的含量 96高级教学 (1)(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜铜 络合物。络合物。 (2)(2)此络合物将试剂

8、磷钼酸此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸磷钨酸( (olinolin试剂试剂) )还原，还原， 混合物深蓝色混合物深蓝色( (磷钼蓝和磷钨蓝混合物磷钼蓝和磷钨蓝混合物) ) 。 97高级教学 98高级教学 凯式定氮法凯式定氮法双缩脲双缩脲杜马斯杜马斯福林福林- -酚酚 原理原理 装置装置 溶剂溶剂 时间时间 灵敏度灵敏度 干扰干扰 总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮 凯式定氮装置凯式定氮装置分光光度计分光光度计高温装置、高温装置、GCGC分光光度计分光光度计 浓硫酸浓硫酸用量较少用量较少不需要不需要福林福林- -酚试剂酚试剂 长长简单快速简单快速3min3min简单快速简单快速 较低较低

9、低低高高高高 较小较小有干扰有干扰较小较小酸类及柠檬酸类及柠檬 酸类酸类 99高级教学 染色法染色法 紫外紫外 吸收法吸收法 水杨酸比色法水杨酸比色法 100高级教学 采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列 记录的数据计算：记录的数据计算： 水份含量水份含量=8.0%，1 号样品重量号样品重量=1.015g，2号样品重号样品重 量量=1.025g，用于滴定的标准，用于滴定的标准HCl当量浓度当量浓度=0.1142N，1 号样品所用的号样品所用的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.0ml，2号样品的号样品的 HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22

10、.5ml，空白的，空白的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数 =0.2ml，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量， 假定该蛋白质含有假定该蛋白质含有17.5%的氮。的氮。 101高级教学 102高级教学 氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性-NH-NH2 2基，又有酸性基，又有酸性-COOH-COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH-NH2 2结结 合，碱性消失，再用强碱来滴定合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH-COOH基。基。 103高级教学 双指示剂：百里酚酞双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂中性红指示剂 104

11、高级教学 二、非水溶液滴定法二、非水溶液滴定法 105高级教学 106高级教学 107高级教学 三、电位滴定法三、电位滴定法 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱 性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞 电极同时插入被测液中构成电池，用电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH NaOH 标准溶标准溶 液滴定，根据酸度计指示的液滴定，根据酸度计指示的pH pH 值判断和控制滴定值判断和控制滴定 的的 终点。终点。 pH8.28.29 9.2.2 108高级教学 测某样品中铁元素的含量，称样测某样品中

12、铁元素的含量，称样1.050g1.050g于坩埚中于坩埚中 灰化，残渣用稀酸溶解后定容至灰化，残渣用稀酸溶解后定容至100mL100mL，吸取，吸取5mL5mL样液样液 于于25mL25mL容量瓶中显色、定容、测定，从标准曲线中查容量瓶中显色、定容、测定，从标准曲线中查 得样液中铁的含量为得样液中铁的含量为4.2g/mL4.2g/mL，请问该样品中铁元，请问该样品中铁元 素的含量为多少？素的含量为多少？ 0.2% 109高级教学 在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg5mg于于100mL100mL 容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL20mL进行测定，用进行测定，用 0.05N0.05N氢氧化钠滴定至氢氧化钠滴定至pHpH值为值为8.28.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液7.0mL, 7.0mL, 加入加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2pH9.2 时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液10