抗体工程重点

1、抗体工程重点 11 / 8 第二章 抗体的结构与功能 * 重点章节。 （一个名词解释） 1、（Ab）:抗原剌激机体后，由浆细胞产生的并能与抗原发生特异性结合的球蛋白。 免疫球蛋白（Ig）:具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 3.功能区： Ig 分子的 H 链和 L 链可通过链内二硫键折叠成若干个球形结构，每一个球形结构由 具有一定的生理功能，称为功能区。又叫结构域。 110 个氨基酸组成， 4.变异度（ variability）: 某一位置的变异度为该位置出现的不同氨基酸数与该位置最常出现的氨基酸残基的出现频率之 间的比值 。 5、免疫球蛋白超家族immunogloblin superf

2、amily IGSF :含有免疫球蛋白折叠结构样功能区的分子。Ig分子超家族的 成员多数为细胞膜表面分子 6、按免疫球蛋白抗原特性分类： 1）同种型： 指同一物种内所有个体的抗体共同具有的抗原特异性， 主要包括 Ig 的类、亚类，型和亚型。 存在于恒定区。 同种型抗原特异性因种属而异， 2）同种异型：是指同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性。可作为遗传标记，存在 Ig 的恒定区。 3）独特型:每一个抗体形成细胞克隆所产生的抗体分子上所特有的抗原特异性。由 不同所决定。 与抗体结合抗原的特异性密切相关。 VH 或 VL 可变区氨基酸序列的 7、CDR表位：VH和VL紧密地结合在一起，

3、形成一个致密的球状结构，成为 叫做CDR表面（CDR surface，即抗原结合部位。 Fv段，6个CDR襻位于Pv段的N端, 8、结合力:抗原抗体的结合依靠静电引力、氢键、范德华力等，需要合适的温度、 这种结合是可逆的。 pH、离子强度及完整的抗体, 9、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 （antibody dependent cell mediated cytotoxicity , ADCC） ： 面抗原结合后，可通过其 Fc段与杀伤细胞表面的 Fc受体相结合，促进对靶细胞的杀伤作用，称为 细胞、中性粒细胞、 NK 细胞 抗体分子与靶细胞表 ADCC单核巨噬 第三章 多克隆抗体（一个简答）

4、1、多克隆抗体的概念 传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同免疫途径免疫动物,由于抗原性物质具有多个抗原决定簇, 激机体产生多种抗体形成细胞克隆, 合成和分泌抗各种决定簇的抗体, 故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物 所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。 以刺 2、抗体应答反应中初次应答和记忆应答的各自的特点。 初次应答：潜伏期长。抗体类型最早产生IgM，接着才产生IgG, 2w2m才产生IgA。抗体总量低。维持时间短。 亲和力弱。 记忆应答:潜伏期短。抗体类型 IgG 为主， IgM 很少。抗体总量高。维持时间长。亲和力强。 3、免疫佐剂: （概念、作用、主要类型） 概念：先于

5、抗原或与抗原混合同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥 辅助作用的物质，被称为佐剂或免疫佐剂。 生物学作用： 1、增加抗原的免疫原性 2、提高抗体的滴度（抗体的滴度其实也就是抗体的浓度 3、改变抗体的类型 IgM IgG 4、引起或增强迟发型超敏反应 佐剂的作用方式：在接种部位形成抗原贮存库 增加抗原的表面积 促进局部的炎症反应 主要的免疫佐剂的类型：无机佐剂；乳化油剂；微生物极其代谢产物；人工合成佐剂；生物分子类。 4、蛋黄抗体 IgY： 概念：是指蛋黄中存在的抗体，也称蛋黄免疫球蛋白 特点：igY化学性质稳定。抗体产量大。成功率高。 应用：作为抗生素的替

6、代品，用于畜禽疾病的预防和治疗。 酶和激素的IgY：尿酶的IgY、胆囊收缩素抗体。 新的饲料添加剂。 第四章 单克隆抗体（ * 重点章节。考一个论述） 1、原理：一个淋巴细胞只接受一个抗原决定簇刺激及经刺激后扩增的淋巴细胞产生均一的同质抗体，此即单克隆 抗体技术的理论基础。 2定义：由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的结构与功能完全相同的同源抗体。 3、单克隆抗体的应用。 A 生命科学研究：蛋白质组学研究领域（人类蛋白质组计划） ；细胞抗原研究及鉴定分类（人类白细胞分化抗原、淋 巴细胞亚群分类、淋巴细胞亚群分离纯化） ；细胞受体研究（受体的分离纯化、细胞定位、结构研究、功能分析

7、） B 疾病诊断与治疗：感染性疾病诊断（检测病原体微生物的抗原、对各类病原体的分型及鉴定） 断（检测血液中的肿瘤标志物） ；其它诊断及研究 ；肿瘤诊断及预后判 疾病治疗（生物导弹 治疗性抗体） 4、单抗制备的实验方案。 A 融合前的准备工作： 组织培养材料的准备 （设备 组织培养用水 培养基 血清 抗生素 ）；小鼠免疫（抗原 动物选择 免 疫途径 载体） B 细胞融合：骨髓瘤细胞的选择（生化缺陷型骨髓瘤细胞系 NS1细胞株，SP2/0细胞株。） 骨髓瘤细胞的培养（细胞处于对数生长期；形态和活性佳（活性大于 含 8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养。 ） 95 %）;约需1X 108个骨髓瘤细胞；融合

8、前用 骨髓瘤细胞悬液的制备 脾细胞悬液的制备 饲养细胞的制备 细胞融合与选择性培养 C杂交瘤细胞的筛选：显微镜观察确定待筛选孔。 2 天以上。 换液后，细胞在37 C、5 % CO2培养箱中培养 从要检测的孔中取100卩I上清用于检测，如 ELISA间接免疫荧光等。 D 杂交瘤细胞的扩增、冻存和克隆化： a 克隆化：使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。 体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。有限稀释法） 将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗 b 冻存：细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度，可在 存。冻存的杂交瘤细胞应处于对数生长中期、健康而活力好。 -196

9、 C液氮或液氮蒸气中长期保 c 细胞的复苏 E单克隆抗体的大量制备 ：制备杂交瘤培养上清；大规模制备杂交瘤培养上清；制备单克隆抗体腹水；单克隆抗体 的纯化（粗提 纯化）。 第五章 基因工程抗体（一个名词解释，一个简答） 1、基因工程抗体：是指根据不同的目的和需要，利用DNA重组技术或蛋白质工程技术，在基因水平上对抗体分子 进行加工、改造和重组装配，然后导入受体细胞进行表达产生的抗体分子。也称第三代抗体。 2、基因工程抗体的优点： 通过基因工程技术的改造，可以最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。 基因工程抗体的分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位。 可以根据治疗的需

10、要，制备多种用途的新型抗体。 4） 可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达系统大量生产抗体分子，成本大大降低。 3、各种类型基因工程抗体的特点，应用、优缺点。 分为以下 7 个问题） 嵌合抗体： 可变区基因克隆的方法：用探针从该杂交瘤细胞系的基因组文库中钓取； 用RT-PCF方法从该细胞的 mRNA中扩增VH及VL基因。 嵌合抗体的表达（提高表达量的方法） 二氢叶酸还原酶（dhrf）扩增系统：CHO的显性选择标记基因转染阳性细胞筛选 甲氨喋呤7 dhfr基因扩增7抗体基因扩增7抗体表达量提高 2）改形抗体：改形抗体构建的原则？ A 在选择骨架区时，从已知的人可变区数据中选择与亲本抗体同源性

11、最高的序列，这样就最大可能的维持原抗体的 天然构象。 B 将骨架区内可能影响抗原结合部位的氨基酸残基替换为亲本鼠单抗的残基 C合适的保留CDR两侧的骨架区序列 D抗体可变区的N末端特别是轻链的 N末端与CDR表面相距很近，这一区域很有可能参与抗原的结合，所以构建改 形抗体时，有必要选择性地将 N 末端的数个氨基酸残基一起移植。 3）抗体库技术人源化：抗体表位定向选择，概念和基本过程。 概念：以鼠单抗可变区为模板，利用噬菌体展示技术，通过抗原导向，筛选能够模拟鼠单抗可变区，结合相同抗原 决定簇的人抗体，称为抗原表位定向选择（EGS）。 过程如下： 优点：可以获得完全的人源抗体 缺点： 成功率不高

12、，所或抗体性能也难以保证 4）小分子抗体：各种小分子抗体的概念和构成。 定义： 具有抗原结合功能的小分子片段，称为小分子抗体。 包括： 抗原结合片段（Fab卜可变区片段（Fv）、单链抗体（ScFv）和单区抗体等。 1、抗原结合片段（Fab）:完整的轻链和Fd组成；分子结构稳定；主要发挥抗体的抗原结合功能；仅有一个抗原结 合位点；分子量50kDa；无Fc段，适合免疫导向诊断和治疗 2、 变区片段（Fv）:由重链可变区 VH和轻链可变区 VL组成。 3、单链抗体（ScFV :在DNA水平用一段长度合适的寡聚核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来, 链的分子。相对分子量较小，仅为完整抗体的 形成

13、单一 1/6。 4、单域抗体：约为完整分子的1/12。只由一个结构域构成，故称单域抗体。 单域抗体亲和力降低，但保持原单抗的特异性。分子小，抗原性弱；易于穿透组织。 5）单链抗体的基本原理和构建流程。 基本原理: 在 DNA 水平用一段长度合适的寡聚核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来， 形成单一链的分子。 构建流程：鼠杂交瘤细胞7提取细胞总RNAt反转录为cDNA第一链7扩增抗体 VH、VL基因7用（Gly4Ser） 3连接 肽基因将VH、VL连成ScFv基因7 PCR扩增ScFv基因并与质粒载体连接7连接产物转化大肠杆菌宿主，筛选阳性克 隆7 ScFv全序列的测定 6）小分子抗体的优

14、缺点 优点：A免疫原性弱，不易引起 HAMA ； B 穿过血管壁或组织屏障进入病灶部位； C肿瘤内定位成像时本底低，图像清晰; D 半衰期较短 , 造影时对周围的组织损伤小； E制备流程简单，可原核表达，制备成本低 ,容易大量制备； F易于进一步进行基因工程改造。 缺点：多为单价，抗原结合能力较弱；半衰期较短，很快从血液中清除，影响治疗的有效浓度。 7）双特异性抗体和抗体融合蛋白：定义、应用 A 抗体融合蛋白：抗体分子片段与其他蛋白融合，得到具有多样性生物功能的融合蛋白。 构建方式：含Fv段的抗体融合蛋白应用：免疫靶向免疫桥连 嵌合受体 含FC段的抗体融合蛋白应用：检测、纯化延长血清中半寿期生

15、物学效应功能 B 双特异性抗体：是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体。特点是：结构双价；功能单价 应用：免疫诊断学上的应用；肿瘤放射免疫显像中的应用；双特异抗体介导的药物杀伤效应；双特异抗体介导的细 胞杀伤效应 第六章 抗体库技术（一个名词解释，一个简答） 1、抗体库技术的概念 即用基因克隆技术将全套抗体（Rep ertoire）重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到表达载体，通过原核或真核直 接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的抗体可变区基因和抗体。 2、 噬菌体抗体库技术的优势 1） 可实现单抗的小型化 2） 可实现单抗的多功能化 3） 4） 可实现抗体的工业化生产 3、 大容量库

16、的构建 抗体库容量多次构建累积，目前报道最大库容在 109-1010 （组合感染法，最大库容6.5X1010 ） 简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵生产、大量制备 A增加基因的多样性（取决于 CDR多样性） B 提高连接和转化效率方法：电穿孔法 优化：提高单次连接和转化效率（载体性质、酶切与连接效率、载体与目的基因的比例；感染态细胞的质量、载体与细菌的比例、点击缓冲液的组成等） 策略：增加连接和转化次数 C高效的包装和呈现效率超噬菌体系统（Hyperphage）PW （分子量小，无空间位阻和干扰效应）辅助噬菌体的选 择（如CT型，减少假噬粒） 4、噬菌粒的概念、特点 概念：噬菌粒 （

17、phagemid）: 是含有丝状噬菌体基因间隔区的质粒载体。 特点： A 本身不含有噬菌体编码蛋白基因，在宿主中不产生子代噬菌体，但在辅助噬菌体超感染下，可包装成成熟 颗粒，并释放、感染新的宿主。 B 若在 phagemid 中克隆入抗体基因，可得到噬菌体抗体。 C Phagemid 在 DNA 重组操作上比较简单，且所建库容量大。 5、 噬菌体抗体库构建的主要技术流程、主要特点。 1） 基因的获取： （ 1）从基因文库中获取可变区基因 （2）用PCR法扩增Ig的VH和VL基因 2) 载体的构建、连接： 3) 表达、淘选 4) 扩增、筛选：抗体库的富集 5) 6、 抗体库技术有哪些方面的应用。

18、 鉴定、分析：序列测定（基因测序）；库容的测定（菌斑）；亲和性测定（ELISA;特异性测定（WB） 在寄生虫学的应用； 微生物的研究； 在肿瘤诊断和治疗方面的应用； 药物设计中的应用； 制备各种功能抗体片段 第七章转人Ig基因小鼠 2、 1、基因打靶技术：是指外源 DNA 与受体细胞染色体 DNA 上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细 胞遗传特性的方法 转基因动物：指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物 3、 转人 Ig 基因小鼠的优点： 1) 携带抗体生成需要的全部基因信息（所带的人 DNA 片段具有完备的功能，可以自主有效的进行同种型转换和亲 和力成熟。） 2）建立种系后，通过免疫获得不同的抗体（任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠使其产生高亲和力的人抗体 3）精确地重现人抗体的产生过程（能够提供几乎完全相同的人免疫球蛋白基因环境并在鼠体内精确的重现了人抗 体的产生过程 4、 转基因动物制备主要流程以及关键点。 DNA 显微注射 J 电转移 ES细胞 受精卵7血细胞胚胎7囊胚7原肠胚7转基因动物 逆