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文档简介

1、荧光定量PCR技术 生化教研室 研究生实验 一、实验目的 ?掌握荧光定量PCR的原理 ?熟悉荧光定量PCR的操作步骤 ?了解荧光定量PCR的应用 二、实验原理 ? ABI Prism?7500 型荧光定量PCR仪 ? 7500功能一览： ? ? 绝对定量(Absolute Quantification) ? 自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分 比 ? ? 相对定量(Relative Quantification) ? ? 等位基因分型(Allelic Discrimination) ? ? 阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC) 实时荧光定量实时荧光定量 PCR技术原理技术原

2、理 ? 聚合酶链式反应（PCR）可对特定核苷酸 片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后， 可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定 性分析，也可以通过放射性核素掺入标记 后的光密度扫描来进行定量分析。无论定 性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。 实时荧光定量实时荧光定量PCR ? 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧 光信号的实时检测从而实现对起始模板定 量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反 应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧 光信号强度也等比例增加。每经过一个循 环，收集一个荧光强度信号，这样我们就 可以通过荧光强度变化监测产物量的变化， 从而得

3、到一条荧光扩增曲线图。 实时荧光定量 PCR 技术： 荧光阈值和CT 值 ? 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的 一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增 阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值 的缺省设置是315个循环的荧光信号的标 准偏差的10倍。 ? 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数被称为CT 值 （threshold value ） 三、三、 实验内容：定量细菌16S RNA基因 ? 引物F： TCCTACGGGAGGCAGCAGT ? 引物R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 扩增片段扩增片段447bp ? Stage1 95 30s 1cyc

4、le ? Stage2 95 5s 60 45s 40cycle ? Stage3 95 15s 60 1min 95 15s 实验分组 ? 按实验台分六组。 ? 第一组：做阴性对照和样品，各做 2个重复。 ? 第二组：标准曲线一个浓度（ 10-1），做2个重复。 ? 第三组：标准曲线一个浓度（ 10-2），做2个重复。 ? 第四组：标准曲线一个浓度（ 10-3），做2个重复。 ? 第五组：标准曲线一个浓度（ 10-4），做2个重复。 ? 第六组：标准曲线一个浓度（ 10-5），做2个重复。 操作步骤：（见下发的资料页） 四、四、 五、实时荧光定量 PCR技术的应用 六、思考题 ?1. 荧光定量PCR的原理和应用实 例。 ?2. 使用SYBR Green I 作荧光染料， 如何提高荧光定量PCR结果可靠性

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