(2021年整理)总RNA的提取定量与RT-PCR

1、总rna的提取定量与rt-pcr总rna的提取定量与rt-pcr 编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（总rna的提取定量与rt-pcr）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快 业绩进步，以下为总rna的提取定量与rt-pcr的全部内容。生物化学实验报告姓 名： 学 号: 专业年级: 级临床八年制 组 别: 第二实验室 生

2、物化学与分子生物学实验教学中心实验名称（title of experimetn)总rna的提取、定量与rt-pcr实验日期（date of experiment）11月27日实验地点(lab no。）第二实验室合作者(partner）指导老师（instructor)总分(total score）教师签名(signature）批改日期(date)【预习报告】一、 实验原理1）总rna的提取与定量在哺乳动物中,平均每个细胞内大约含有105g rna,其中rrna占总量的8085%，trna和核内小分子rna占10-15%，而mrna只占1-5。rrna由28s、18s、5s等几类组成，这些rna分

3、子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mrna分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mrna分子(除血红蛋白、有些组蛋白mrna以外)，在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polya)。利用此特点，用oligo(dt）亲和层析柱分离mrna. rna分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法,蛋白酶k-细胞质rna提取法等、异硫氰酸胍酚-氯仿一步法等。目前常用的是trizol法。 trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离rna.trizol的主要成分是异硫氰酸胍和酚.异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白

4、质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中还加入了8羟基喹啉、巯基乙醇等来抑制内源和外源rnase.在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相,rna选择性地进入无dna和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收rna；用乙醇沉淀中间层可回收dna；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物,植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成.分离的总rna无蛋白质和dna污

5、染,可用于northern blot，dot blot,ploya筛选，体外翻译，rnase保护分析和分子克隆.在用于rt-pcr时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无rnase的dnase处理rna样品，避免出现假阳性.共纯化的dna可用作标准,比较不同样品rna的得率，也可用于pcr和酶切。蛋白质可用于western blotting。 2）逆转录聚合酶链反应 （reverse transcriptionpolymerase chain reaction，rt-pcr) 提取组织或细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，采用oligo(dt）或随机引物利用逆转录酶反转录成cdn

6、a。再以cdna为模板进行pcr扩增，而获得目的基因或检测基因表达。rtpcr使rna检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量rna样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cdna探针、构建rna高效转录系统。 二、 实验材料1)总rna 的提取1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄pcr反应管 2. trizol试剂 3。 氯仿 4. 异丙醇 5. 75乙醇6。 无rnase的水或0.5sds (溶液均需用depc处理过的水配制) 2）rt-pcr1。 基因扩增仪（如pe geneamp pcr system 2400 或 9700)、微量加样枪、凝胶

7、成像系统、灭菌超薄pcr反应管 2rna提取试剂 3第一链cdna合成试剂盒4dntp mix:含datp、dctp、dgtp、dttp各2 mmol/l5taq dna聚合酶 三、 实验步骤（一）总rna的提取 1。 匀浆处理： a。组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10. b.单层培养细胞 直接在培养板中加入trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数.trizol加量不足可能导致提取的rna有dna污染。 c.细胞悬液

8、离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml trizol,反复吸打。加trizol之前不要洗涤细胞以免mrna降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量rna的前提;细胞数量与trizol的比例，细胞的数量不能过多.） 2. 将匀浆样品在室温（15-30)放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉,植物结节部分等）可于2-8 10000g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖，高分子量dna，上清中含有rna。处理脂肪组织时,上层有大

9、量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4。 每使用1ml trizol加入0。2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。） 5. 2810000g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿)有机相，上层为无色水相和一个中间层.rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60。 6. 把水相转移到新管中（如要分离dna和蛋白质可保留有机相),用异丙醇沉淀水相中的rna。每使用1ml trizol加入0.5ml异丙醇,室温放置10 min。 7。 2810000g离心10 min，离心前看不出rna沉淀，离心后在管

10、侧和管底出现胶状沉淀.移去上清。 8。 用75乙醇洗涤rna沉淀.每使用1ml trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5 min，弃上清。 9. 室温放置干燥或真空抽干rna沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解,大约晾510min。加入25-200l无rnase的水，70保存。 (二)rt-pcr 1。 总rna的提取：见前述内容. 2. cdna第一链的合成：目前试剂公司有多种cdna第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一.现以takara公司提供的primescripttm 1st strand cdna synthesis kit试剂盒为例。 （1）在0.2

11、ml微量离心管中，加入以下： 总rna 15 g 、dntp 1 l 、random primer 1 l 、补充适量的depc h2o使总体积达10 l。轻轻混匀、离心。 （2）pcr仪上65加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 (3）然后加入下列试剂的混合物： 5primescript buffer 4 l 、rnase inhibator 0.5 l 、rtase 1 l 、rnase free h2o 4。5 l ,轻轻混匀，离心。 （4） 30孵育10 min. （5） 42孵育60 min. (6)于70加热15 min以终止反应,将管插入冰中。 3pcr：本次实

12、验采用premix taq version2.0(loading dye mix）试剂 （1）取0.5ml pcr管，依次加入下列试剂：第一链cdna 2 l 、上游引物（10pmol/l）2 l 、下游引物（10pmol/l）2 l 、dntp（2mmol/l） 4 l 、10pcr buffer 5 l 、taq酶（2u/l） 1 l 。（2)加入适量的ddh2o,使总体积达50 l。轻轻混匀，离心。 （3）设定pcr程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参（如g3-pd)的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照。

13、 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 (5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。 四、实验注意事项1、本实验大部分为rna操作，注意rna酶的污染。2、快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有rnase污染.3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。【实验记录】一、 实验条件见第一、第二部分。二、 实验现象1、 琼脂糖凝胶电泳图像:反转录dna条带marker带从凝胶电泳的图像上看,本组的反转录dna条带可以看到与marker带对应的特异性条带,但特异性不明显，也出现了弥散或非特异性条带。【结果与讨论】一、结果如上图所示。三、 讨论（1)特异性反