人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

1、人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏南通大学(医学版)?413?journalofnantonguniversity(medicalscien!)q!(鱼人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离,培养,鉴定及冻存,复苏杨晓清,张沐,杨兵,张华,张玉泉f?南通大学附属医院妇产科,z南通大学医学院i临床071班,南通226001,江苏省干细胞库)【摘要】目的:探讨从人脐带华通氏胶(whaaonsjelly,wj)中分离,培养,鉴定间充质干细胞(mesenchymalstemce11s,mscs)及其冻存,复苏的方法.方法:采用植块法分离,培养间充质干细胞,流式细胞仪检测p3代细胞免疫表

2、型,鉴定其向成骨,成脂方向诱导分化的能力;将pl细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性.结果:植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14-18d细胞融合70%-80%:p3代细胞强烈表达cd73,cd90,cd105,不表达cd14,cd34,cd45,cd79a和hladr;成骨诱导分化后10d,可见明显钙结节;成脂诱导14d,有明显的脂滴出现,油红o染色阳性.冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨,成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性.结论:组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离,培养出纯度较高间充质干细胞,冻存,复苏不改变

3、其特性.关键词人脐带间充质干细胞;华通氏胶;细胞培养;诱导分化;冻存中图分类号】r394.2【文献标志码a文章编号1674-7887(2010)06041304isolation,culture,identification,frozennessandthawofmesenchymalstemcellsfromwhartonsjellyofhumanumbilicalcordyangxiaoqing,zhangmu,yangbin,zhanghua3,zhangyuquan(departmentofgynaecologyandobstetrics,affiliatedhospitalofnan

4、tonguniversity;departmentofclinicalmedical,class071,medicalcollegeofnantonguniversity,nantong226001;departmentofstemcellbank,jiangsuprovince)abstract】objective:toexploretheapproachofisolating,culturing,identifing,frozeningandthawingmscsfromwhartonsjellyofhumanumbilicalcord.methods:humanumbilicalcord

5、mesenchymalstemcells(hucmscs)wereseparatedbycultureoftissueadherence.thesurfaceofpassage3cellsurfaceantigenwasmeasuredbyflowcytometry.theosteogenicandadipogenicdifferentiationwastestedandevaluatedbyspecificstainingmethods.passage1cells,frozen6months,werethawed,thentheirbiologicalcharacteristiswereid

6、entified.results:mscswereeasilyobtainedfromwhartonsjetlyofhumanumbilicalcordviatheproposedapproachoftissueadherence.after6daysofincubation,cellswerepresented.theprimacellsgrewupto70%-80%confluenceafter14-18daysofculture.flowcytometryanalysisrevealedthatcd73,cd90andcd105werehighlyexpressedonthesurfac

7、eofpassages3cells,buttheexpressionwasnegativeforcd14,cd34,cd45,cd79aandhladr.thesecellsshowedcalciumnodeaftercultureinductionofosteogenicdifferentiation10dayslater.furthermore,liquidvacuolesweredetectedbyoilredostainingaftercultureinductionofadipogenicdifferentiation14dayslater.thelivingcellsofhucms

8、cswere80%afterhavingbeenfrozenandthethawedcellshadthesamecharacteristisasprivious.conclusion:cellsfromthehumanumbilicalcordshavebeenisolatedbytissueculturemethod,whichhavethebiologicalcharacteristicsofmscs.keywords】humanumbilicalcordmesenchymalstemcell;whartonsje11y;cellculture;differentiation;cryop

9、reservation间充质干细胞(mesenchymolstemcells,mscs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的多能干细胞,具有显着的自我更新和多向分化能力.目前mscs的主要来源为成人骨髓及脐血,但成人骨髓源mscs数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降1,病毒感染率较高,且供者mscs的采集因需行骨髓穿刺术而受限.脐血mscs的分离会损失脐血中造血干细胞.近年研究显示,人脐带中也存在大量mscs;脐带来源mscs具有来源广泛,取材方便,相对纯净,含量丰富及免疫原性低等优点,正逐渐成为mscs研究领域的热点之一.人脐带mscs的来源有4种,其中华通氏胶(wj)来源的mscs含量丰富但对

10、其分离培养的研究相对较少,本文就探讨从人脐带华通氏胶中分离出脐带间充质干细胞fumbilicalcordmes.enchymalstemcells,ucmscs)并进行体外培养,鉴定及定向分化,为mscs的应用提供更广泛的来源.【基金项目2010年南通大学研究生创新基金资助(ykc10051)【作者简介杨晓清,女,汉族,生于1978年8月,江苏省南通市人,在读研究生,研究方向:生育调节.通信作者张玉泉,电话emaihjsnt_?414?南通大学(医学版)1材料和方法1.1材料正常足月剖宫产新生儿脐带f泰州人民医院);dmem/

11、f12培养基(hyclone公司);胎牛血清(excellbiology,inc);tryple酶,成脂,成骨诱导试剂盒(invitrogen公司);二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)(sigma公司);cd14一fitc,cd45一fitc,cd79a_apc,cd90一apccd34一pecd73一pecd105一pehladrpe(bd公司);倒置相差显微镜(olympus公司);流式细胞仪(bectondickinson公司);培养瓶,培养皿,离心管(coming公司).1.2方法1.2.1脐带华通氏胶mscs的分离与培养取正常足月产健康新生儿脐带10on,两端

12、丝线结扎,浸泡于含dmem保存瓶中.超净台内取出脐带.75%乙醇消毒脐带表面23min,剪开两端结扎丝线.生理盐水充分洗涤残留的血液,将脐带剪成2cm小段,再次漂洗,剖开脐带,剔除脐静脉,脐动脉,剥离华通氏胶(图l3).将华通氏胶剪成1mmxlmmxlmm大小,接种于含10%胎牛血清的dmem培养瓶内,放入37,5%co培养箱中培养.倒置显微镜每天观察细胞生长情况._图l剪成2cm脐图2剔除脐静脉图3剥离的华通带小段及脐动脉氏胶1.2.2脐带华通氏胶mscs表型的测定用流式细胞仪对p3代ucmscs表面特异性抗原进行检测.tryple酶消化待检细胞,pbs洗涤3次,制成lxl06/ml的细胞悬

13、液.将待检细胞样品分为每管0.1ml,加人cd14一fitc,cd45一fitc,cd79aapc,cd90一apc,cd34一pe,cd73一pe,cd105一pe,hladrpe抗,4孵育30min,流式细胞仪测定各类抗原的阳性率.1.2i3脐带华通氏胶mscs诱导分化向成骨细胞诱导分化:将p3代细胞消化后,调整细胞密度为l1o5/ml,接种于24孔板内,12d后细胞融合达70%80%,此时以成骨细胞诱导培养液培养,每3天全量换液1次,第10天茜素红染色;向脂肪细胞诱导分化:培养液改为成脂肪细胞诱导培养液,其余同前,第14天油红0染色.1.2.4脐带华通氏胶mscs的冻存,复苏将p1代ms

14、cs消化后以1xl06/ml密度冻存,冻存液dmso:fbs:dmem为1:l:8,将冻存细胞放入4预冷的程序冷冻盒内,直接将程序冷冻盒放入一8occ冰箱,第2天放人一196oc液氮保存.冻存6个月后将程序冷冻盒从一80冰箱取出,细胞直接放人37clc预热的水浴锅内,用4预冷的pbs洗涤细胞2遍,将细胞接种于含10%胎牛血清的dmem培养瓶内,放人37oc,5%co培养箱中培养.待细胞传代至p3代时,用流式细胞仪检测cd14,cd45,cd79a,cd90,cd34,cd73,cd105,hladr.并进行成骨细胞,成脂细胞诱导分化,方法同前.2结果2.1脐带华通氏胶mscs的分离与培养成功从

15、脐带分离出wj,植块培养.用倒置显微镜观察.12d见组织块部分贴壁,6d左右组织块周围有细胞爬出(图4),10d左右细胞已有成片聚集,聚集处呈火山喷发状.细胞多为双突起的长梭形,短棒状或扁平形的成纤维样细胞,核仁明显.l418d时,细胞融合达70%80%,此时消化,传代,去除组织块,传代后细胞生长能力明显增强,至p2代以后,隔天细胞即需传代.细胞密度较低时成扁平单层细胞,细胞密度较高时趋于融合,细胞变细长.类似成纤维细胞,呈平行或旋涡状生长(图5).图4组织块周边细胞游出图5脐带华通氏胶mscs细(40x)胞形态(40x)2.2脐带华通氏胶mscs的表面标志的测定流式细胞仪检测mscsp3代细

16、胞,cd73,cd90,cd105呈阳性表达,cd14,cd34,cd45,cd79a和hladr阴性表达(图6,7).ijit.p呦ititit-ii,timll罨1器.=l:器ti1.r1l:籀10si.:-bpi露器=:i图6mscs表面抗原分子cd73,cd90,cd105呈阳性表达2-3脐带华通氏胶mscs成骨,成脂诱导分化的形杨晓清,等.人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离,培养,鉴定及冻存,复苏?415?jllm$311-cd14tm.pm_ltfm3-45ll.pcmmillnmtlnl?-lp啊itll帅湘?-|erttilpre_?啦p?f_ra锶o.2鼍:誉93.8fi蟋e,

17、o?ee937聪ll_j罨图7mscs表面抗原分子cd14,cd34,cd45,cd79a,hladr呈阴性表达态变化经成骨诱导45d即可见孔板底物白色钙本文采用植块法,分离培养脐带wj中的质沉积;10d后茜素红染色可见明显钙结节(图8,9,mscs,组织块大小lmmx1ram1mm,6d左右可见见封-).经成脂诱导第7天,镜下见折光性很强的细胞从组织块边缘游出,1418d细胞可铺满瓶底液滴,随着诱导时间延长,空泡增多;诱导第14天油的70%80%,此时传代自然沉淀片刻,去除组织块.红0染色,高倍镜下可见胞浆中有大量被染成红色传代后细胞生长迅速,p2代后隔天即可传1代.流的液滴f图10,l1,

18、见封二).式细胞仪鉴定该种细胞具有mscs特性,且纯度高.2.4脐带华通氏胶mscs冻存及复苏冻存6个月成骨诱导分化45d可见白色骨质沉积,10d后成再复苏.细胞活力大约为80%.复苏后的mscs细胞骨染色强阳性;成脂诱导7d可见脂滴,14d成脂染传至p3代其表面表型的测定及成骨,成脂诱导结果色强阳性.说明此方法分离的mscs具有多向分化与未冻存的人脐带间充质干细胞类似.潜能.将p1代细胞在一8occ冻存后放人液氮中,6个3讨论正常足月新生儿的脐带是连于新生儿脐部与胎盘问的索状结构,外被羊膜,内含分化的黏液性结缔组织和两条脐动脉和一条脐静脉.脐血管周围被黏蛋白样组织所包裹,后者被称为脐带胶质,

19、或华通氏胶,它富含透明质酸,形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构【】.脐带中富含造血,问充质,神经及内皮等多种干/祖细胞4-7.1991年mcelreavey等181首次报道.从人脐带的wj中分离并培养到了一种成纤维样细胞,具有较高的分化潜能,可向多个方向进行分化.后陆续有报道通过植块法或酶消化法在wj中可获得mscsi5-6,91,使脐带有望成为骨髓mscs的理想替代来源.人脐带wj中mscs的分离与培养.目前使用的方法主要有酶消化法和植块法.酶消化法具有快速分离出mscs的优势,但是酶体系可能会降解细胞外膜,甚至对细胞造成损害,细胞将无法贴壁.徐燕等l31通过比较上述2种方法获贴壁细胞的形态学

20、特征,细胞产率等认为.植块法可简便,高效的分离出一群具有高增殖活性及多向分化潜能的mscs.细胞产率高,传代后细胞形态及增殖活性稳定.蒋洁等研究认为,植块法易从人脐带wj胶中获得成纤维样细胞,这种细胞从形态结构,表面抗原标志及诱导分化能力等方面都表现为mscs特性.月后复苏.细胞活力达到80%左右,流式细胞仪鉴定及诱导分化提示mscs特性未受影响.在mscs分离,培养,鉴定及冻存复苏过程中有如下体会:尽量在脐带采集24h内进行分离剥胶;尽量不用双抗进行培养,以免对细胞活力等影响;可在结扎线剪去之前在超净台内用75%乙醇消毒脐带表面12min,再用生理盐水漂洗干净后去除结扎线:同时将保存液送微生

21、物检测以确定是否有潜在污染;将脐带剪成2cm左右的小段有利于剥胶操作,并将表面及动静脉血管内的血液充分漂洗干净,防止脐血细胞的影响;脐静脉剪开,内膜要剔除干净,防止静脉内皮下干细胞混杂;完整剔除脐动脉;剥胶时不能撕破外层的羊膜层,以免影响wj中mscs的纯度;分离的wj要充分剪碎,培养时平铺均匀,放置培养箱后尽量减少翻动.冻存时用含10%dms0,10%胎牛血清的冻存液.细胞1xl0/ml放入冻存管后,放人4预冷的程序冷冻盒后可直接放人一80冰箱,第2天放人一196液氮保存;复苏时使细胞在较短时间内复温,有利于保存细胞活力.【参考文献】11raoms,mattsonmp.stemceilsan

22、daging:expandingthepossibilitiesj.mechageingdev,2001,122(7):713734.【2】trevisanutod,doglionin,zanardov,eta1.overcoilingoftheumbilicalcordj.jpediatr,2007,150(1):112-112.3penghq,levitinsmithm,(下转第419页)吴玮.等.外周血nfkb基因表达水平对肝癌诊断的临床价值研究?419?(上接第415页)rochelsonb,eta1.umbilicalcordstrictureandovercoilingarecom

23、moncausesoffetaldemisej.pediatrdevpathol,2006,9(1):1419.4】沈华,沈尊理.脐带间充质干细胞的研究jnji.中国美容医学,2oo7,l6(8):11581160.【5】wanghs,hungsc,pengst,eta1.mesenchymalstemcellsinthewhaonsjellyofthehumanumbilicalcordj1.stemcells,2004,22(7):13301337.6】sarugaserr,lickorishd,bakshd,eta1.humanumbilicalcordperlvascular(hucp

24、v)cells:asourceofmesenchymalprogenitorsj.stemcells,2005,23(2):220229.7】troyerdl,weissml.whaonsjelly-derivedcellsareaprimitivestromalcellpopulation叨.stemcells,2008,26(3):591-599.f8】mcelreaveykd,irvineai,enniskteta1.isolation,cultureandcharacterisationoffibroblastlikecellsderivedfromthewhartonsjellypoaionofhumanumbilicalcordj.biochemsoctram,1991,19f1):29s一33.9】lullliuyj,yangsg,eta1.isolationandcharacterizationof