酶的定向进化课件

1、酶的定向进化,1,酶的定向进化技术,酶的定向进化,2,一、定向进化的潜力,酶的定向进化,3,生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。,天然酶的作用,酶的定向进化,4,利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用。,酶的定向进化,5,随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入

2、，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能,天然酶的局限,天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。,酶的定向进化,6,现代生物工程的要求,天然酶需各种生物分子之间协调，工业酶主要考虑活力与稳定性，能具备长期稳定性和活性 天然酶作用环境与应用环境的差异，能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料,酶的定向进化,7,如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景。,酶的定向

3、进化,8,二、酶的定向进化简介,易错pcr、DNA改组、高突变菌株,酶的定向进化,9,1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。,蛋白质定向进化概念的提出,酶的定向进化,10,定向进化与自然进化比较,自然进化非常缓慢，环境的多样性和适应方式的多样性决定了进化方向的多样性。 定向进化模仿自然进化的关键步骤：突变、重组、筛选,酶的定向进化,11,酶分子研究,认识与改造 改造： 合理设计（化学修饰、定点突变） 非合理设计（定向进化、杂合进化）,酶的定向进化,12,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变

4、，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。,定向进化技术,酶的定向进化,13,理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件.所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制1，通过

5、人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力,酶的定向进化,14,定向进化的原理,酶的定向进化,15,定向进化随机突变选择,酶的定向进化,16,随机突变的策略,易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR

6、) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术,酶的定向进化,17,易错PCR,易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。 PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72,酶的定向进化,18,易错 PCR,是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋

7、白质分子的随机突变体。 在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有35校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变， 构建突变库。,酶的定向进化,19,连续易错PCR,连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 注：易错 PCR突变率需仔细调控，不能高低，靶基因取代碱基1.55个，经常一次突变很难获得满意的结果。将一次易错 PCR获得的小突变累计产生重要的有益突变。,酶的定向进化,20,Chen等人5，6用此策略使在非水相

8、（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定向进化2, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换.,酶的定向进化,21,其他无性进化,化学诱导剂 65度下直接用羟胺处理带

9、有目的基因片段的质粒，内切酶切下突变了的基因片段，再克隆表达 致突变菌株 注：遗传变化只发生在单一分子内部属于无性进化,酶的定向进化,22,DNA改组,DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，原理如图所示。,注：切割成随机片段，再进行不加引物的PCR循环，片段之间互为引物或模版，直到获得全长的基因。该策略将亲本基因群中优势突变尽可能结合在一起。,酶的定向进化,23,DNA改组,该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”.

10、 通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变9, 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体1015.,酶的定向进化,24,外显子改组,外显子改组(exon shuffling类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。 注：改造幅度小但更实际,酶的定向进化,25,外显子改组（exon shuffling）16，17类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子

11、改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库.,酶的定向进化,26,杂合酶,杂合酶（hybrid enzyme）18是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合.杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子.

12、 杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实1925,酶的定向进化,27,体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质,酶的定向进化,28,该法优于DNA改组法的特点在于： （1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可1020倍地降

13、低亲本DNA量; （2） 在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去DNase , 故RPR方法更简单; （3） 合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变; （4） 随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制.,酶的定向进化,29,交错延伸,交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,酶的

14、定向进化,30,交错延伸,StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程28. 该法简便且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具.,酶的定向进化,31,酶法体外随机-定位诱变,为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)2932.该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又

15、让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用.,酶的定向进化,32,定向进化的筛选策略,琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使

16、用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。,突变体分离,酶的定向进化,33,通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,酶检测,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁,酶的定向进化,34,通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关34，35. Venekei等人36报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选

17、择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株.Roberts等人37用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.610 6倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍38.另有一些其他的筛选方法39，40, 如加入能产生可见光信号的底物17或利用绿色荧光蛋白的荧光性质 41等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败.,酶的定向

18、进化,35,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：,进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。,酶的定向进化,36,定向进化的优势、现状和未来,较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机

19、制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题11，4244，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要

20、几百万年的进化过程缩短至几年 10，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径45、抗辐射性 46、生物合成途径47、对映体选择性48、抗体库 49以及DNA结合位点定向进化50的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景.,酶的定向进化,37,酶的体外定向进化应用实例,酶的定向进化,38,定向进化技术,Fig. 1. Publication rate of the dir

21、ected evolution articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words directed evolution in their titles

22、.,酶的定向进化,39,定向进化的应用,酶的定向进化,40,关键问题,应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键问题: （1） 确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2） 选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的起始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便可能中途“夭折”; （3） 若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4） 建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而

23、引起的功能变化.目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大规模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能是今后该领域科学家切实努力的目标.,酶的定向进化,41,展望,总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。 我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性

24、能优良的酶制剂。,酶的定向进化,42,参考文献,Nikolaos E. Labrou. Directed enzyme evolution: Bridging the gap between natural enzymes and commercial applications. Biomolecular Engineering 2005,22:viiix. Haiyan Tao. Milestones in directed enzyme evolution. Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6:858864. Linda G. Otten

25、. Directed evolution: selecting todays biocatalysts. Biomolecular Engineering 2005,22:19 Edgardo T Farinas. Directed enzyme evolution. Current Opinion in Biotechnology 2001, 12:545551 Valery A. Detection of biological threats. A challenge for directed molecular evolution. Journal of Microbiological

26、Methods 2004,58: 147 168 Nicholas J. Turner. Directed evolution of enzymes for applied biocatalysis. TRENDS in Biotechnology 2003,11(21):474-478 Joel R Cherry. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Current Opinion in Biotechnology 2003, 14:438443 Paul A Dalby. Optimising enzyme function by directed evolution. Current Opinion in Structural Biology 2003, 13:500505