生化药物生产实训报告

1、报告1、生化药物生产安全应急预案一、实验室规则 （一）实验要求1、 实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。2、 实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；结果不良时，必须重做。3、 实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。4、 实验结束后，根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交老师审阅。 （二）仪器保管及清洁1、 常用仪器在首次实验时，按仪器清单进行清点，并负责保管，若有缺损到实验准备室换领，实验中如有仪器破损必须登记，期末如数归还。2、 实验后，必须把玻璃仪器洗净放入柜内，按次序放置好，以提高工作效率

2、并防止破损。3、 贵重仪器尤其要尽力爱护，非本次实验使用的仪器未经老师允许不得乱动；本次实验必须要用的仪器，在使用前要了解使用方法，严格遵守操作规程。4、 公用仪器如、分光光度计、电动离心机等，每组同学使用时间不宜过长，以免妨碍其他同学使用。5、 玻璃仪器清洗、一般玻璃仪器都应用洗衣粉或去污粉洗涤；铬酸洗液勿用于普通玻璃仪器之洗涤，用过的铬酸洗液须加以保存，直到变为绿色方可弃之，其舍弃法与浓硫酸液相同；蒸馏水的使用，应遵循少量多次原则。 （三）试剂使用规则1、 使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。2、 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错；用好后放回原处，未用完的试剂

3、不得倒回瓶内。3、 取标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准溶液。4、 使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置以免试剂流入橡皮帽内。5、 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取；若用吸管时要用吸球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 （四）安全注意事项1、 低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应远离火源；若须加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。2、 凡属发烟或产生有毒气体的化学实验，均应在通风柜内进行，以免对人体造成危害。3、 若发生酸碱灼烧事故，先用大量自来水冲洗。酸灼伤者用饱和nahco3溶液中和，碱灼伤者用饱和h3bo3溶

4、液中和，氧化剂伤者用nas2o4处理。4、 若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、co2或ccl4灭火器扑灭。5、 离开实验室前必须关好窗户、切断电源、水源，以确保安全。 （五）废弃物处理1、 所有固体废物如、用过的滤纸、碎屑沉淀物等必须弃于垃圾桶中。2、 浓酸必须弃于小钵中，用水冲淡，然后倒入水池中。3、 实验完成后之沉淀或混合物若含有可提取之贵重物品者，不可随意舍弃，应交教师保管。 （六）实验室清洁1、 实验室必须常保持清洁，不得随地吐痰，乱丢纸屑。2、 实验后要清扫实验台面、地面，试剂瓶要摆放整齐。3、 下课时轮流由值日生打扫卫生，经教师检查，方能离开实验室二、实验室常识1、挪

5、动干净玻璃仪器时，勿使手指接触仪器内壁。拿吸管时切勿用手触及其尖端需放入液体中的部位。2、洗净的仪器要放在架上或干净纱布上晾干，不能用抹布擦拭，更不能用抹布擦拭仪器的内壁。吸管、搅拌等用后要放在架上或底部垫有干净纱布的烧杯内，切勿乱放在实验台上，实验台要保持清洁整齐。3、量瓶是量器，不要用作盛器。4、量瓶等带有磨口玻璃塞的仪器塞子，不要盖错。洗涤时塞子和仪器本身要放在一起，以免弄混。不用时要用纸条把塞子和瓶口隔开。抹过凡士林的磨口玻塞要用有机溶剂将凡士林洗净后，再用纸条隔开放置。5、不要用滤纸称量药品，也不要用滤纸作记录。6、不要用石蜡封闭精细药品的瓶口，以免掺混。7、标签纸的大小应与容器相称

6、，贴在试剂瓶或烧杯的上2/3处，试管等则贴在上部。标签上应写明物质的名称、规格和浓度、配制的日期和配制人。8、标准试剂烘干后，应以称量瓶放在干燥器中。称取后立即放回干燥器备用。9、取用试剂和标准溶液后，需立即将试剂瓶塞严，放回原处。取出的试剂和标准溶液如未用尽，切勿倒回瓶内，以免掺混。取标准溶液时，应根据需要倒出一定量于干净烧杯内，再用移液管由烧杯中量取。不能用移液管直接由试剂瓶量取。10、凡是发生烟雾、有毒气体和有臭味气体的实验，均应在通风橱内进行。橱门应关闭，非必要时不能打开。11、用动物进行实验时，在杀死或解剖等操作中，必须按照规定方法进行。不许戏弄动物，绝对不能用动物、手术器械开玩笑。

7、12、在实验室工作时要紧张严肃。不许谈天说笑，更不许大声喧哗或互相打闹。实验室的药品器材，未经允许不得带出实验室。13、在实验过程中，要将实验的结果及时如实地记录下来，数据要记在一定的记录本中，不要随便记在纸条上，以免丢失。需要拍照的及时拍照。记录不能随意涂改。14、要爱护仪器和节省药品。贵重仪器在使用前应熟知使用方法。使用时，要严格遵守操作规程。发生故障时，应立即停止仪器的运转，告知管理人员。切勿擅自拆修。使用后应按规定登记。三、实验室突发事故应急处理预案（一）实验室火灾应急处理预案：1、发现火情，现场工作人员立即采取措施处理，防止火势蔓延并迅速报告；2、确定火灾发生的位置，判断出火灾发生的

8、原因，如压缩气体、液化气体、易燃液体、易燃物品、自燃物品等；3、明确火灾周围环境，判断出是否有重大危险源分布及是否会带来次生灾难发生；4、明确救灾的基本方法，并采取相应措施，按照应急处置程序采用适当的消防器材进行扑救；包括木材、布料、纸张、橡胶以及塑料等的固体可燃材料的火灾，可采用水冷却法，但对珍贵图书、档案应使用二氧化碳、卤代烷、干粉灭火剂灭火。易燃可燃液体、易燃气体和油脂类等化学药品火灾，使用大剂量泡沫灭火剂、干粉灭火剂将液体火灾扑灭。带电电气设备火灾，应切断电源后再灭火，因现场情况及其他原因，不能断电，需要带电灭火时，应使用沙子或干粉灭火器，不能使用泡沫灭火器或水。可燃金属，如镁、钠、钾

9、及其合金等火灾，应用特殊的灭火剂，如干砂或干粉灭火器等来灭火。5、依据可能发生的危险化学品事故类别、危害程度级别，划定危险区，对事故现场周边区域进行隔离和疏导；6、视火情拨打“119”报警求救，并到明显位置引导消防车。（二）实验室爆炸应急处理预案：1、实验室爆炸发生时，实验室负责人或安全员在其认为安全的情况下必需及时切断电源和管道阀门；2、所有人员应听从临时召集人的安排，有组织的通过安全出口或用其他方法迅速撤离爆炸现场。3、应急预案领导小组负责安排抢救工作和人员安置工作。（三）实验室中毒应急处理预案：实验中若感觉咽喉灼痛、嘴唇脱色或发绀，胃部痉挛或恶心呕吐等症状时，则可能是中毒所致。视中毒原因

10、施以下述急救后，立即送医院治疗，不得延误。1、首先将中毒者转移到安全地带，解开领扣，使其呼吸通畅，让中毒者呼吸到新鲜空气；2、误服毒物中毒者，须立即引吐、洗胃及导泻，患者清醒而又合作，宜饮大量清水引吐，亦可用药物引吐。对引吐效果不好或昏迷者，应立即送医院用胃管洗胃。孕妇应慎用催吐救援。3、重金属盐中毒者，喝一杯含有几克mgso4的水溶液，立即就医。不要服催吐药，以免引起危险或使病情复杂化。砷和汞化物中毒者，必须紧急就医。4、吸入刺激性气体中毒者，应立即将患者转移离开中毒现场，给予2%5%碳酸氢钠溶液雾化吸入、吸氧。气管痉挛者应酌情给解痉挛药物雾化吸入。应急人员一般应配置过滤式防毒面罩、防毒服装

11、、防毒手套、防毒靴等。（四）实验室触电应急处理预案：1、触电急救的原则是在现场采取积极措施保护伤员生命。2、触电急救，首先要使触电者迅速脱离电源，越快越好，触电者未脱离电源前，救护人员不准用手直接触及伤员。使伤者脱离电源方法：切断电源开关；若电源开关较远，可用干燥的木橇，竹竿等挑开触电者身上的电线或带电设备；可用几层干燥的衣服将手包住，或者站在干燥的木板上，拉触电者的衣服，使其脱离电源；3、触电者脱离电源后，应视其神志是否清醒，神志清醒者，应使其就地躺平，严密观察，暂时不要站立或走动；如神志不清，应就地仰面躺平，且确保气道通畅，并于5秒时间间隔呼叫伤员或轻拍其肩膀，以判定伤员是否意识丧失。禁止

12、摇动伤员头部呼叫伤员。4、抢救的伤员应立即就地坚持用人工肺复苏法正确抢救，并设法联系校医务室接替救治。（五）实验室化学灼伤应急处理预案：1、强酸、强碱及其它一些化学物质，具有强烈的刺激性和腐蚀作用，发生这些化学灼伤时，应用大量流动清水冲洗，再分别用低浓度的（2%5%）弱碱（强酸引起的）、弱酸（强碱引起的）进行中和。处理后，再依据情况而定，作下一步处理。 2、溅入眼内时，在现场立即就近用大量清水或生理盐水彻底冲洗。每一实验室楼层内备有专用洗眼水龙头。冲洗时，眼睛置于水龙头上方，水向上冲洗眼睛冲洗，时间应不少于15分钟，切不可因疼痛而紧闭眼睛。处理后，再送眼科医院治疗。报告2、动物组织中核酸的提取

13、与鉴定实训名称动物组织核酸提取与鉴定实训目的学习和掌握核酸提取的工作原理和基本操作技术。实训原理核酸是生物体最重要的组成成分之一。动物组织细胞中的核糖核酸（rna）与脱氧核糖核酸（ dna）大部分与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。因此分离核酸时必须使核酸与蛋白质分离，并除去蛋白质。本实验是将组织匀浆后加水饱和酚溶液，振荡使蛋白质变性，变性蛋白质溶于酚相或两界面处形成凝胶层。而dna或rna则溶于上层的水盐溶液中。在离心后上层的水盐溶液中加入乙醇，核酸不溶于乙醇而形成白色絮状沉淀析出。dna与 rna均由单核苷酸组成，每个单核苷酸中含有磷酸、嘌呤与嘧啶、戊糖（核糖、脱氧核糖)。核酸用硫酸水解后，

14、即可游离出这三种物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质。（1）磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨基萘酚磺酸还原成蓝色钼蓝（2）嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化合物。（3）戊糖:a.核糖:用硫酸使之生成糠醛，糠醛与3，5二羟甲苯综合成为一种绿色化合物b.脱氧核糖：在硫酸作用下，与二苯胺生成蓝色化合物试剂介绍钼酸铵试剂、氨基萘酚磺酸、3，5二羟甲苯溶液、二苯胺试剂、0.9%nacl、20三氯醋酸、水饱和酚、预冷的95乙醇、浓硫酸、5%硝酸银、5%硫酸实训步骤实训步骤一：动物组织中核酸的提取1. 匀浆制备：全班制备一份。取冻存兔肝20g置匀浆器中，加入0.9%nacl溶

15、液60ml制成匀浆。2. 提取：将匀浆取出分装在四个100ml塑料离心管内，分别加入1mol/l nacl溶液15ml，混匀，再加入水饱和酚溶液40ml，剧烈振荡10min，然后4000rpm离心20min。将上清轻轻吸入一烧杯中，每2人一组取上清液4ml于小离心管中，加入等量的预冷的95%乙醇，即可见白色沉淀逐渐析出，静置10min后，3500rpm离心10min，倾去上清，即得白色的核酸钠沉淀。实训步骤二、核酸的水解在含有核酸钠盐的离心管内加入5%硫酸4ml，用玻璃棒混匀，转入小试管中，在沸水浴中加热15min。实训步骤三、dna与rna成分鉴定（1）嘌呤碱的鉴定：试管号水解液5%硫酸浓氨

16、水5%硝酸银1 220滴20滴数滴呈碱性数滴呈碱性10滴10滴加入硝酸银后，观察有什么变化？静止15min后再比较两管中沉淀颜色有何变化？（2）磷酸的鉴定管号水解液5%硫酸钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸1210滴10滴5滴5滴20滴20滴沸水浴中加热数分钟，观察两管颜色变化。（3）核糖的鉴定：管号水解液5%硫酸3，5二羟甲苯溶液124滴4滴6滴6滴沸水浴中加热10min，比较两管颜色变化。（4）脱氧核糖的鉴定管号水解液5%硫酸二苯胺试剂1220滴20滴30滴30滴沸水浴中20min观察颜色变化思考题1、剪掉的猪肝置于什么溶液中？（0.14mol/l nacl溶液）2、95%乙醇的作用是什么？（沉淀，除

17、盐）3、加异戊醇的作用？（消泡，有助于分层）4、常规的pr变性沉淀剂？（氯仿、重金属、三氯醋酸、苯酚、sds）课后复习1生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。来源：（1）动物脏器 （2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难 （4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精

18、制和成品的制作2.细胞破碎常用的技术：（1）高压匀浆法（2）高速珠磨法（3）超声波法（4）化学法（5）酶解法（6）渗透压冲击法（7）冻结-融化法（8）干燥法常用的溶酶：溶菌酶、透明质酸酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等。3. 生物分离技术：是指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。4. 离心分离技术：是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。5. 常用的紫外线波长有两种（ b ）a. 256nm和365nm b254nm和365nm c. 254nm和367nm d. 256n

19、m和367nm6. 下列细胞破碎的方法中，哪个方法属于非机械破碎法( a )a.化学法 b. 高压匀浆 c. 超声波破碎 d.高速珠磨7. 常用离心设备可分为（离心沉降）和（离心过滤） 两大类8. 生物分离的基本原理？主要是依据离心力、分子大小（筛分）、浓度差、压力差、电荷效应、吸附作用、静电作用、亲和作用、疏水作用、溶解度、平衡分离等原理对原料或产物进行分离、纯化。不同的分离对象需要采用不同的分离方法才能有效地被分离。9. 生物分离技术的基本涵义及内容？ 注：实训记录图片见附录。报告3、sephadexg50分离核黄素与丙种球蛋白实训名称丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离实训目的1.学习和掌握分

20、子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术。2学会使用sephadexg50分离核黄素与丙种球蛋白。实训原理在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时该物质在这两种介质中的浓度比是一常数称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中，无论是少量分析还是大量制备，都能体现出它的高效性，简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸层析薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等。 以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤 凝胶过滤

21、的别名很多，如凝皎扩散层析，分子筛层析，排阻层析等。这种技术具有操作简便，回收率高(近100)，条件缓和等特点，但它的分离操作速度较慢。该法常用于蛋白质，多糖，核酸的分离纯化。 凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为va，它包括填料的骨架体积vgm。，填料的孔体积vi(内水体积)及填料颗粒间的体积vo(外水体积)。分布在填料的孔中的溶剂是固定相，分布的填料颗粒间的溶剂是流动相。填料颗粒含有许多不同大小的孔如果待分离的物质分子大小合适，则可以不同程度地向孔中扩散，大分子物质只能占有较少的大孔，小分子则能占有大孔及另外一些小孔。所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱时，较

22、小的分子在柱中停留的时间比大分于停留的时间长，于是混合物中各组分即按分于大小分开，最先流出的是最大的分子。示意图如下所示， 用于生物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶(商品名为sephadex)，聚丙烯酰胺凝胶(商品名为biogel)，琼脂糖凝胶(商品名sepharose)等。如常用的交联葡聚糖是将葡聚糖(dextran)悬浮于有机溶剂，加入交联剂表氯醇交联聚合而成多糖链的三维结构，这种聚合物为白色珠状微粒，是多孔性网状结构，凝胶的孔径大小与交联剂的量有关，交联剂多则交联度大，网状结构紧密，孔径小，反之交联剂少则孔径大。 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品

23、小心自柱顶端加入，洗脱，以分步收集器收集洗脱液，测定每管物质浓度，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线：由图可见最先流出的物质是，a，它的分子量最大，大于该种凝胶的排阻限(a物质分子的直径大于凝胶的孔径)，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，与外水体积vo相等。最后流出的物质是c，它的分子量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫“全渗入”。流经体积是外水体积vo与内水体积vi的和。而物质b的分子量介于排阻限与渗入限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中，不能全部地不受限制的通过，这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。

24、它的流经体积ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即 ve=vo+kdvi式中kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。kd=(ve-vo)vi当kd=1时，ve=vo+vi为全渗入。当kd=0时，ve=vo为全排阻。当0kdt，则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。这三种物质的分离过程可见示意图如下： vi也可通过计算求出：vi=awra=凝胶千重wi=每克干凝胶吸水毫升数vt=vo+vi+vgvg=凝胶骨架体积vt=可通过测定层析柱内径及高度计算得出：vt=14d2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格：基本操作仪器介绍基本操作：装柱、样品处理、上样、洗脱、分部收集

25、测定设备：层析柱（玻璃柱），铁架台实验步骤1取直径081.2cm，长度为25cm的层析柱，在上口箍橡皮筋，出口处装上乳胶管，柱内加注蒸馏水23ml，排出乳胶管内的气泡，抬高乳胶管防止柱内的蒸馏水排空。自顶部缓缓加入经膨胀的葡聚糖g-50悬液。待底部凝胶沉积23cm时将乳胶管放低，仍继续加入上述悬液至凝胶层积至18cm高度即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。让凝胶自然下沉，使表层平整。待凝胶柱层稳定后，以洗脱液(蒸馏水)洗柱5分钟，调节流速至4滴每分钟。 2. 待蒸馏水流至柱面平时，(注意，不可使柱面干掉)，马上沿层析柱内壁小心加4滴样品于柱床面，注意尽量不使床面搅动，马上加入12倍于

26、样晶体积的蒸馏水，反复两次后，可加大量蒸馏水连续洗脱，这样可以使样品稀释最小。 3样品一旦加入后马上用量筒或刻度离心管收集流出液，柱床上不断加蒸馏水，待红色(血红蛋白)流出一半时记录毫升数，此为血红蛋白ve也为vo。继续收集流出液，待黄色(核黄素)流出一半时记录体积，此为核黄素ve。 4测出柱床体积(vt)，外水体积(vo)内水体积(vi)，及核黄素的洗脱体积(ve)。并计算出hb及鱼精蛋的分配系数(kd)。 5用蒸馏水反复加在柱床上面，洗柱10分钟然后将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。注意事项1在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度控制在4滴/min。2加样时，保持凝胶上平面不被搅动。3液面

27、要始终高于凝胶上平面，否则会导致干柱4装柱避免出现断层、气泡，思考题1、凝胶层析的基本原理2、装柱不均匀或有气泡、干裂,会造成什么后果,为什么?课后复习1层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。2 分配层析：是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。3凝胶色谱分离的依据是（ b ）。a、固定相对各物质的吸附力不同 b、各物质分子大小不同c、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 d、各物质与专一分子的亲和力不同4如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下

28、的物质分开选用（ d ）。a、sephadex g-200 b、sephadex g-150 c、sephadex g-100 d、sephadex g-505洗脱体积是（ c ）。a、凝胶颗粒之间空隙的总体积 b、溶质进入凝胶内部的体积c、与该溶质保留时间相对应的流动相体积 d、溶质从柱中流出时所用的流动相体积6分子筛层析指的是（ c ）a. 吸附层析 b分配层析 c. 凝胶过滤 d. 亲和层析7那一种凝胶的孔径最小（ a ）a. sephadex g-25 b sephadex g-50 c. sephadex g-100 d. sephadex g-2008在凝胶过滤（分离范围是5000

29、400000）中，下列哪种蛋白质最先被洗脱下来（ b ）a细胞色素c（13370）b肌球蛋白（400000）c过氧化氢酶（247500）d血清清蛋白（68500）e肌红蛋白（16900）9在生物制剂制备中，常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液；碳酸盐缓冲液；盐酸盐缓冲液；醋酸盐缓冲液等。（ ）10层析分离是一种化学的分离方法。（ ）11蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法） ，（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法） 。12试述凝胶色谱的原理？答：将混合原料加在柱上并用流动相洗脱，则无法进入孔隙内部的大分子直接被洗脱下来，小分子因为可以进入孔隙内部而受到很大的阻滞，最晚被洗脱下来，

30、而中等大小的分子，虽然可以进入孔隙内部但并不深入，受到的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。13简述凝胶层析有哪些用途？作为分析工具；作为脱盐工具生物大分子的浓缩除热原物质生物大分子的分离纯化；分子量的测定14试述柱层析的基本操作过程。答：1、装柱：干法装柱 湿法装柱( 注意：湿法装柱中柱内预留一部分水，防止气泡的产生，装柱过程要连贯。平衡。)2、加样：干法加样湿法加样(注意：加样过程中，要防止产生飞溅，量要适中。)3、洗脱：以设定好的流速加入洗脱剂，可以是单一溶剂，也可以梯度洗脱。（ 注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一层溶液。）4、收集：每隔10ml收集一试管，使用层析的手段或紫外

31、检测器进行实时的检测，合并具有相同物质的流份。注：实训记录图片见附录。报告4、聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙球蛋白实训名称聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙球蛋白实训目的1.学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的工作原理和基本操作技术。2学会使用聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙球蛋白。实训原理聚丙烯酰胺的特性1凝胶透明，有弹性，机械性能好；2化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；3对ph和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；4样品用量少，灵敏度可达10-6g;5凝胶孔径可调节；6分辨率高。电泳法的定义及作用原理1 定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析

32、方法,我们称之为电泳法。2 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。实训仪器试剂配置仪器：1.电泳仪 2. 电泳槽 3. 注射器 4. 长针头 5. 吸管 6. 培养皿试剂：1. 三羟甲基氨基甲烷（简称tris） 2. 贮备液的配制：按下表配制a、b、c、d、e、f各贮备液，然后冷藏于4条件下，以防变质。 3. 染色液： 0.05%氨基黑10b溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝r250溶液染色。 4. 脱色液：7%醋酸溶液。 5. 电极

33、缓冲液（ph8.3甘氨酸-tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，tris0.6g加水定容至1000ml. 6. 示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。实训步骤1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。 1）7%聚丙烯酰胺凝胶，将试剂按a:c:h2o:f=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加水覆盖，在烘箱中2535下聚合，当有界面出现时，吸取分离胶表面的水分。 2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶：按b:d:e:f=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，用滴管加到分离胶上面。 加入1cm高左右，加入一层薄水。烘箱，待第二次出现

34、界面，除去表面水分。 2.安装胶管：把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。 注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。 先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。3.加样 ：0.5ml新鲜血清，用5ml 20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释 。用微量注射器或移液枪向胶管内加 20ul 样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。4.电泳：上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流 3ma 电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管 5ma 。 当示踪剂移至胶管下端 1cm 处时，关闭电源，取出胶管。

35、电泳大约 2-3 小时。5剥胶：取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。6.染色及洗脱：a.将取下的胶条放入 12.5% 三氯醋酸中固定10min，用 1% 考马斯亮蓝水溶液染色 15min，7% 醋酸过夜保存。 b.将取下的胶条放入 7% 三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10b 染色15min，7%醋酸浸泡过夜。 注:染液回收7.观察绘图 ：将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。注意事项1凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电

36、泳区带不整齐。2电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热使分离失败。3电泳开始，样品应于5min10min内进入凝胶柱内为佳。4所有玻璃管和绿套头，在剥胶完毕后回收。所有乳胶帽，在胶凝固后都回收。5药品大部分有毒，应注意防护。思考题1、 溴酚蓝的作用？（示踪剂）2、 样品中加入4%蔗糖的作用？（防止对流，蔗糖密度比较大，可以自然沉降）注：实训记录图片见附录。报告5、超氧化物歧化酶sod的生产实训名称超氧化物歧化酶sod的生产实训目的学习和掌握sod的生产的工作原理和基本操作技术。实训原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)，作为一种专一清除生物体内超

37、氧阴离子自由基(o2-)的酶，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少超氧阴离子自由基对生物体的毒害。sod的分类：1 铜和锌型，称为、-，是最常见的一种，动物sod呈蓝绿色，植物sod呈白色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。2 锰，称为-，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内3 铁，称为-，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。实验原理（沉淀法)超氧化物歧化酶（sod）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化氧负离子（o2-）进行岐化反应，生成氧和过氧化氢：2o2- + h2 = o2 + h2o2 。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的sod，组织或细