病毒的纯化和检测概要

1、病毒感染的纯化与诊断,第一节,病毒的纯化,一、病毒纯化前的准备工作,繁殖病毒,利用生物学方法纯化病毒,二、标本的采取与送检,应注意下列原则,1,对本身带有杂菌,如咽拭子、粪便,或易,受污染的标本，要进行病毒分离培养时,应使用抗生素,2,因病毒在室温中易失去活性，标本应低,温保存并尽快送检,3,血清学诊断标本的采取应在发病初期和,病后各取血清，以便对比双份血清抗体效,价的动态变化,三、病毒和病毒成份的提纯,病毒纯度的判定依据,物理均一性,病毒滴度与蛋白含量的比例,免疫反应单一而无非特异反应,结晶形成,在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释,放出来,病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方,法,对大小、

2、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术,病毒提纯的主要原则,四、病毒萃取液的分级纯化,沉淀法,中性盐沉淀法,聚乙二醇沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,离,心,法,差速离心法,速率区带离心法,密度梯度离心法,等密度区带法,凝胶色谱法,电泳法,第二节,病毒的检测,病毒的感染单位,IU,：能够引起宿主或宿主细,胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量,病毒效价,指单位体积,ml,病毒悬液的感染单位,数目,IU,ml,或称毒力,噬菌体效价,pfu,又称噬菌斑形成单位数指单,位体积的噬菌体，能使感染细菌裂解，产生噬菌,斑的数量,因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过,100,所,以根据噬菌斑或

3、空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌,体电镜下观察数低,一、侵染力的测定,半致死剂量,LD50,使半数宿主细胞死亡,的病毒剂量称,半致死剂量,半致感染剂量,ID50,使半数宿主细胞发,生感染的病毒剂量,半数组织培养感染剂量,TCID50,使半数,组织培养物发生感染，产生细胞病变效应,的病毒剂量,二、病毒的培养,1,动物接种,是最原始的病毒培养方法，根据病毒,种类不同，选择敏感动物及适宜接种部,位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接,种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角,膜或皮内,2,鸡胚培养,鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化,9,14,天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒,标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的

4、鸡,胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿,囊膜和卵黄囊等,3,组织培养法,tissueculture,或细胞培养,cellculture,法,是将离体活组织块或分散的组织细胞加以,培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最,常用的基本方法,1,细胞的变化,有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变,称为细胞病变效应,CPE,常见的变化有细胞变圆,聚集、坏死、溶解或脱落等,有些病毒如麻疹病毒,CMV,RSV,等,作用于细胞膜,可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融,合细胞,有些病毒,如狂犬病病毒、麻疹病毒等,可在培养,细胞中形成胞浆或核内的包涵体,病毒在培养细胞中增殖的指标,病毒培养时出现的,C

5、PE,2,红细胞吸附,hemadsorption,HAd,流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜,上出现了血凝素,haemagglutinin,HA,具有吸,附脊椎动物,豚鼠、鸡、猴等,红细胞的能力，这,一现象称红细胞吸附，常用来测定具有,HA,的粘病,毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能,中和细胞膜上的,HA,HAd,不再发生，称红细胞吸,附抑制试验,3,干扰现象,interference,某些病毒感染细胞时不出现,CPE,或其他易,于测出的变化,如,HAd,但能干扰在其后感,染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染,Vero,细胞时,CPE,不明显，但它能干扰后感,染的埃可病毒,ECHO

6、V,的增殖，从而阻抑,后者所特有的,CPE,4,细胞代谢的改变,病毒感染细胞的结果可使培养液的,pH,值,改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生,了变化。这种培养环境的生化改变也可作,为判断病毒增殖的指标,二,病毒的数量与感染性测定,1,蚀斑测定,是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法,将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中,病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养,琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散,结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中,可产生一个局限性的感染灶。用活性染料,如,中性红,染色，则活细胞着色，受病毒感染而,破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑,plaque,每个蚀斑是由一个感染性病

7、毒颗,粒形成的，称作蚀斑形成单位,plaque,forming unit,PFU,病毒悬液中的感染性,病毒量的滴度可用,PFU,ml,表示,Plaque forming unit, PFU,2.50,组织细胞感染量,TCID50,测定法,该方法是测定病毒能使,50,的组织培养细,胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬,液作,10,倍的系列稀释，分别接种细胞,经一定时间后观察,CPE,血细胞吸附等,指标，以最高稀释度能感染,50,细胞的,量为终点。最后用统计方法计算出,50,组织细胞感染量,三、病毒感染的血清学诊断,原理是用已知病毒抗原来检测病人血,清中有无相应抗体，故须待病人感染后体,内产生抗体时

8、才能检出,另外，在采取临床标本及病人血清应,注意病程，必须采取患者急性期血清与恢,复期血清,双份血清,进行血清学试验。若,第,2,次血清抗体滴度比第,1,次高出,4,倍以上时,1,免疫沉淀法,使,Ag-Ab,形成不溶性的沉淀,2,中和试验,neutralizing test,NT test,是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中,和而失去感染性的一种试验,中和抗体是作用于病毒表面抗原,衣壳或,包膜,的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉,特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和,抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以,前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于,人群免疫情况的调查，在临床诊断上较

9、少使用,3,补体结合试验,complement fixation,test,CF test,如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原,则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指,示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而,不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反,应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则,在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系,统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因,此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体,或用已知抗体来检测相应抗原,补体结合试验图示,受检系统,指示系统,溶血反应,补体结合试验,1,仅有抗原或抗体,补,体,红,细,胞,溶血素,阳性,阴性,2,抗原抗体反应,红细胞,

10、溶血素,阴性,阳性,抗原,抗体,补,体,抗原,抗体,4,凝胶扩散法,Ag,和,Ab,5,酶联免疫吸附测定法,enzyme-linked,immunosorbent assay,简称,ELISA,以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原,的特异结合反应为基础，通过酶活力测定,来确定抗原（或抗体）含量,ELISA,的基本类型,先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上,并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶,标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附,的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗,原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用,底物催化显色，进行定性或定量测定,根据检测目的和操作步骤不同，有,竞

11、争法,双,抗体夹心法,间接法,三种类型的常用方法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗,体。以测定抗原为例,将抗原吸附于固相载体；加入,待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗,原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于,固相的抗体与待测抗原含量呈负相关,竞争法,此法常用于测定抗原,将已知抗体吸附于固相载,体,加入待检标本,含相应抗原,与之结合。温,育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定,双抗体夹心法,此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附,于固相载体，加入待检标本,含相应抗体,与之,结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体,酶标,抗抗体,和底物进行测定,间接法,四、病毒核酸

12、检测,杂交法,用于病毒检测的有斑点杂交,细胞内原位杂交,DNA,印迹杂交,RNA,印迹杂交等,PCR,法,目前多数病毒基因已通过分子克,隆技术被明确了核苷酸序列，使得,DNA,扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一,反转录,PCR,基因芯片技术,又称,DNA,芯片、生物芯片,biochip,其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针,大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测,样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反,应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受,器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果,其优点是：可以一次性完成大量样品,DNA,序列的,检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不,足

13、。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学,调查方面有着广阔的应用前景,第二节,病毒感染的预防,一、人工自动免疫,一,活疫苗,attenuated vaccine,or living,vaccine,1,常规活疫苗即减毒活疫苗,attenuated,vaccine,通常是用自然或人工选择法,如,温度敏感株,筛选的对人低毒或无毒的变异,株制成的疫苗，如脊髓灰质炎、流感、麻,疹的减毒活疫苗等,2,新型活疫苗,应用基因工程技术，控制病,毒变异，或利用,DNA,重组技术，插入和定,向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白的编,码基因插入活载体中或选择性地去除病毒,的某一个或几个致病基因而达到减毒作用,制备的可在

14、机体内增殖，诱发抗病毒免疫,应答的疫苗,二,死疫苗,killed vaccine,1,灭活全病毒疫苗,应用物理或化学方法使病毒完,全灭活而制成的疫苗。常用的有乙型脑炎、狂犬,病、流感等灭活疫苗,2,亚单位疫苗,subunit vaccine,制备不含有病毒核,酸、仅含有能诱发中和抗体的病毒衣壳蛋白或包,膜表面抗原，是最理想的疫苗,3,合成肽病毒疫苗,synthesized peptide viral,vaccine,人工合成与病毒保护性抗原决定簇的氨,基酸序列相同的肽段，制备成免疫原后免疫动物,或人体，使机体产生保护性抗体,4,基因工程疫苗,geneenginering vaccine,利用基

15、,因工程技术，分离、重组、转化和表达基因，制,备出的能引起人体保护性免疫应答疫苗,5. DNA,疫苗,又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸,分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因,以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机,体产生特异性体液和细胞免疫,6,新型多价联合疫苗、口服疫苗的研究,减毒活疫苗与死疫苗优缺点比较,特点,减毒活疫苗,死疫苗,制备方法,通过非正常培养减毒株,通过化学物理方法使感,染失活,免疫接种,一般为一次性,多次免疫,疫苗的稳定性,相对不稳定,相对稳定,免疫的类型,体液免疫和细胞免疫,体液免疫,毒力回升,有可能,不可能,安全性,对免疫缺陷者有危险,安全性好,生产和成本,生产

16、较复杂、成本高,生产简单、成本低,二、人工被动免疫,人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白,或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不,同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋,白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲,型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者,不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用,含有高滴度抗,HBs,的乙肝免疫球蛋白,Ig,预防乙型,肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰,期短，故应注意有效期,第三节,病毒感染的治疗,一、抗病化学制剂,一）核苷类药物,核苷类药物的作用机制有,主要是抑制病毒基因,复制模拟核苷成分掺入病毒基因组：合成的异,常嘧啶取代病毒,DN

17、A,前体的胸腺嘧啶，病毒在复,制过程中，这种异常的嘧啶分子掺入子代,DNA,中,使子代病毒结构基因的合成和表达无法进行，从,而抑制病毒的复制，或复制出的病毒为缺陷病毒,竞争病毒复制酶,1,无环鸟苷,acyclovir,ACV,阿昔洛韦,和,丙氧鸟苷,ganciclovir GCV,庚昔洛韦,为鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤核苷类似物,该药,细胞毒性很小，是目前最有效的抗疱疹病,毒药物之一。广泛用于疱疹病毒感染引起,的单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹,2,叠氮胸苷,azidothymidine,AZT,胸腺嘧啶核苷类似物，通过阻断前病毒,DNA,的,合成而抑制,HIV,的复制,AZT,对病毒逆转录酶的抑,制比

18、对细胞,DNA,多聚酶敏感,100,倍以上。可以有,效地降低,AIDS,的发病率与病死率。耐药株的出现,系由基因突变导致逆转录酶具有耐药性。因有抑,制骨髓作用和形成病毒的耐药而面临被淘汰,3,病毒唑,对多种,RNA,和,DNA,病毒的复制都有抑制,作用，但主要用于,RNA,病毒感染的治疗,对细胞的核酸也有抑制作用。目前临床主,要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗,二）病毒基因转录抑制剂,这类核苷衍生物模拟天然二脱氧核苷底物,经一系列磷酸化成为,5,三磷酸后，作为相,似的底物竞争性抑制病毒逆转录酶活性,被磷酸化的药物分子与核苷酸分子相似,在,RNA,模板合成,DNA,过程中被嵌入,DNA,中,此

19、,DNA,再转录时，由于其中的药物分子不,是正常的核苷酸，因而转录酶不能识别,从而使转录受阻,三,非核苷类逆转录酶抑制剂,nevirapine,第,1,个新合成的非核苷类逆转,录酶抑制剂,1996,年获准用于治疗,HIV,耐,药株已出现，故建议与其它药联合使用,pyridone,作用类似,nevirapine,四）蛋白酶抑制剂,1,赛科纳瓦,saquinavir) 1995,年批准的第,1,个蛋白酶抑制剂,2,英迪纳瓦,indinavir,瑞托纳瓦,ritonavir,是,1996,年批准的新一代蛋白酶,抑制剂，用于,HIV,五）其他抗病毒药物,1,金刚烷胺和甲基金刚烷胺,金刚烷胺为合成胺类,甲基金刚烷胺是其衍生物，两者有相同的抗病毒,谱和副作用，能阻止脱壳，主要用于治疗甲型流,感,2,甲酸磷霉素,无机焦磷酸盐的有机类似物，抑制,多种疱疹病毒，包括,CMV,HSV,VZV,EBV,HHV6,可能还对,HBV,和逆转录病毒有作用。选,择性抑制病毒,DNA,多聚酶和逆转录酶，而对宿主,细胞无影响,二、干扰素和干扰素诱生剂的应,用,1,干扰素,IFN,具有广谱抗病毒作用，毒性,小，使用同种,IFN,无抗