循环肿瘤细胞通过诱导系统性炎症及调控中性粒细胞的功能促进播散肿瘤细胞转移克隆的形成

1、循环肿瘤细胞通过诱导系统性炎症及调控中性粒细胞的功能促进播散肿瘤细胞转移克隆的形成尽管肿瘤的检测和治疗手段不断进步 , 但肿瘤的远处转移依然是导致肿瘤相关死亡的最大原因。 循环肿瘤细胞在临床多种不同类型的肿瘤病人体内都能检测出来 , 并且体内高水平的循环肿瘤细胞往往导致肿瘤病人的差预后及生存期缩短。临床上 , 循环肿瘤细胞可以作为液态活检的目标用来预测病人的预后及监测肿瘤的复发情况。 但除了被认为是肿瘤转移起始细胞的来源外 , 关于循环肿瘤细胞是否能通过其他机制影响肿瘤转移还知之甚少。目的 : 本研究为了探索循环肿瘤细胞对肿瘤转移的作用及其作用机制。 方法 :(1) 利用两种转移能力不同的细胞

2、系 -B16F0 和 B16F1细胞 , 分别构建循环肿瘤细胞小鼠模型(cir-B16F0 鼠) 和肿瘤转移模型 (B16F1 荷瘤鼠 );(2) 小鼠尾静脉先后接种 B1F0细胞和 CFSE标记的 B16F1细胞 , 并分别于接种 B16F1后 5 h和 24 h 处死小鼠并取其肺脏 , 然后冰冻切片并荧光显微镜下观察肺组织中 CFSE标记肿瘤细胞的分布情况 ;(3)ELISA 检测不同动物模型血清中促炎因子 -IL-6 和 IL-1 - 的浓度 ;(4) 免疫组化检测不同模型小鼠肺组织中中性粒细胞的浸润情况 ;(5)B16F1 荷瘤鼠和 B16F0与B16F1混合接种鼠通过腹腔注射anti

3、-Ly6G 单克隆抗体体内清除中性粒细胞 , 然后观察观察其肺脏表面转移结节形成情况;(6) 从不同动物模型体内分离其骨髓和腹腔趋化来的中性粒细胞, 并将其与 B16F1细胞混合接种到正常小鼠大腿肌肉, 荷瘤 12 天后去小鼠肌肉肿瘤组织并称重 ;(7) 体内转染表达抗炎因子 -IL-37的质粒 , 观察炎症对循环肿瘤细胞促进肿瘤转移及对中性粒细胞功能调控作用的影响 ;(8)real-time PCR 检测 cir-B16F0 小鼠骨髓中性粒细胞中促瘤相关基因 -Mmp9,Bv8,Arg1 和 Nos2及抑瘤相关基因 -Trail和 Rab27a的表达 ; 分离 cir-B16F0小鼠腹腔趋化

4、来的中性粒细胞并体外用肿瘤组织间液 (T-sMs) 刺激培养 12 h 后 real-timePCR检测上述促瘤和抑瘤相关基因的表达 ;(9) 通过酶底物反应检测cir-B16F0小鼠腹腔中性粒细胞中MPO的释放 , 及通过流式细胞术检测cir-B16F0小鼠腹腔中性粒细胞表面与其脱颗粒相关的表面标记分子-CD63的表达情况 ;Western blot 检测 cir-B16F0 小鼠腹腔中性粒细胞中与脱颗粒相关的信号通路 -p38MAPK和 PI3K 信号通路的激活情况 ;(10) 分别用real-time PCR和 ELISA检测 cir-B16F0小鼠肺脏和脾脏中Csf3(g-csf)和

5、Il6的 mRNA水平 , 及其血清中 G-CSF,IL-6 和 IL-1 的水平 ;(11)cir-B16F0小鼠体内中和IL-1后real-time PCR检测其肺和脾中Csf3(g-csf)和II6的 mRNA水平 ;(12)Westernblot检测cir-B16F0小鼠血清和肺脏中TLR2和TLR4配体-HMGB1,HSP70,S100A8,S100A9和SAA3的水平 ;(13)cir-B 16F0小鼠体内转染表达可溶性TLR2(sTLR2)和TLR4(sTLR4)质粒 ,观察TLR2/4 配体对循环肿瘤细胞诱导炎症反应和促进肿瘤转移的影响。结果 :(1) 循环肿瘤细胞通过促进播散

6、肿瘤细胞 (B16F1) 的转移克隆形成进而促进肿瘤转移 ;(2) 循环肿瘤细胞可以诱导 IL-6,IL-1 等促炎因子的表达 , 进而诱导系统性炎症反应 ;(3) 循环肿瘤细胞促进肺组织中中性粒细胞的浸润 ;(4) 体内清除中性粒细胞导致循环肿瘤细胞不能促进 B16F1细胞肺转移 ;(5) 循环肿瘤细胞促进中性粒细胞中Mmp9,Bv8,Arg1和 Nos2基因的表达 , 而抑制 TRAIL 和 Rab27a的表达 ;(6) 循环肿瘤细胞上调中性粒细胞对肿瘤微环境刺激物的反应性;(7) 循环肿瘤细胞减弱中性粒细胞的脱颗粒能力及 p38MAPK和PI3K 细胞信号通路的激活 ;(8) 体内转染表

7、达 IL-37 能有效抑制循环肿瘤细胞诱导的系统性炎症反应及其对中性粒细胞功能的调控作用,但 IL-37 并不能直接作用于B16F1细胞 , 同时也不能直接影响循环肿瘤细胞对中性粒细胞的功能及反应性的调控作用;(9)cir-B 16F0小鼠肺脏和脾脏中Csf3(g-csf)和Il6的 mRNA水平上调,同时 , 其血清中 G-CSF和IL-6的水平也上调;(10)cir-B16F0小鼠中和IL-1后,其肺和脾中 Csf3(g-csf)和 Il6的 mRNA水平均显著降低 ;(11)cir-B16F0 小鼠血清中 TLR2/4 配体 -HMGB1和 HSP70水平上升。同时 , 上调的 TLR2/4 配体进一步促进小鼠肺组织中内源性 TLR2/4配体 -S100A8,S100A9 和 SAA3的表达。这些 TLR2/4 配体共同促进 G-CSF,IL-6 和 IL-1 的表达 ;(12) 体内转染表达可溶性 TLR2(sTLR2) 和 TLR4(sTLR4),可以有效抑制由循环肿瘤细胞诱导的 G-CSF,IL-6 和IL-1 浓度的上调