间充质干细胞培养方法

1、间充质干细胞培养方法1. 间充质干细胞MSC基本形态2. 干细胞应用与干细胞调控。3. 间充质干细胞MSC生长过程4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境5. 细胞培养板的选择6. 如何选用细胞培养基7. 如何维持培养液 p H8. 血清与干细胞的培养9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活10. 细胞的细菌、真菌污染及排除11. 细胞培养污染的预防12. 使用胰蛋白酶时加入 E DTA的目的是什么13. 胶原酶的种类和选型14. 胶原酶 V S胰酶15. 干细胞的种类和表面标记16. 间质干细胞培养原理概述17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化18. 干细胞老化的表现和处理19. 细胞传代

2、消化过程指导20. 冷冻保护剂作用和选择21. 细胞冻存指导22. 干细胞冷冻和复苏23. 移植细胞的基因修饰1间充质干细胞MSC基本形态体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出23 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。2干细胞应用与干细胞调控干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。2.1内源性调控干细胞自身有许多

3、调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。（1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。（2）转录因子的

4、调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与-

5、Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。2.2外源性调控除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。（1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGF家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而 GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积

6、。Wnts 的作用机制是通过阻止-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch 信号都起着非常重要的作用。当Notch 与其配体结合时，干细胞进行非分化性

7、增殖；当Notch 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。（3）整合素（Integrin）与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节1整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。2.3干细胞的可塑性越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强的可塑性。通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999 年 Good

8、ell 等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5 天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation ）。关于横向分化的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。3间充质干细胞MSC生长过程潜伏期指数增生期停滞期（1）潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时,细胞质回缩, 胞

9、体呈圆球形，然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束。细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。（2）指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mito

10、tic index, MI ）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于 0.1%-0.5% ，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达35。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 35 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合

11、成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。（3）停滞期(Stagnate phase) 细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发

12、生死亡，因此，应及时传代。4间充质干细胞MSC培养的合适气体环境干细胞相关的培养液都必须在 5 CO2 的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞

13、生长。5细胞培养板的选择细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U 型和V 型）；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki 板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。（1）平底和圆底（U 型和V 型）培养板的区别和选择 不同形状的培养板有不同用途。培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTT 等实验时，无论是贴壁和悬浮细胞，一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特別注意材质，标示“Tissue Culture (TC) Tr

14、eated”是养细胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养時，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U 型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内內。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U 型板替代（加入细胞后，低速离心)。 （2）Terasaki 板和普通细胞培养板的区别Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种 sitting 和 handing drop

15、两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface （3）细胞培养板与酶标板的区别 酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，需要更高的要求和特定的酶标工作液。（4 ）常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量 不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在

16、23mm 范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。常用的培养器皿 培养器皿 底面积（cm2） 加培养液量（mL） 可获细胞量96 孔培养板 0.32 0.1 10524 孔培养板 2 1.0 510512 孔培养板 4.5 2.0 1066 孔培养板 9.6 2.5 2.51064 孔培养板 28 5.0 71063.5cm 培养皿 8 3.0 2.01066cm 培养皿 21 5.0 5.21069cm 培养皿 49 10.0 12.210610cm 培养皿

17、 55 10.0 13.710625cm 塑料培养瓶 25 5.0 5.210675cm 塑料培养瓶 75 1530 210725cm 玻璃培养瓶 19 4.0 3106100cm 玻璃培养瓶 37.5 10.0 6106250cm 玻璃培养瓶 78 15.0 21072500cm 旋转培养瓶 700 100250 2.5108注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以293 细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。 6如何选用细胞培养基培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。细胞培养基大致有： （1）合成培养基 主要

18、成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。常用的有：199细胞培养基及其改良品种。 1950年由Morgan 等设计，除BSS 外，含有53 种成分，添加适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。 199 （HB）细胞培养基，主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗，具有高缓冲性能，能够有效提高病毒滴度。BME细胞培养基。基础Eagle 培养基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 设计，BSS12 种氨基酸谷氨酰胺8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改

19、良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM 等。MEM细胞培养基。低限量Eagle 培养基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，适合多种细胞单层生长，是一种最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。需要注意的是，MEM 细胞培养基有含 Earles 平衡盐的类型，也有含 Hanks平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有含非必需氨基酸的类型。生产和科研时，应根据实际情况注意选择合适的MEM 细胞培养基。另外，因MEM 培养基营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳

20、或者最经济的培养基。DMEM细胞培养基及其改良品种。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA 转染的转化细胞培养。例如CHO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO 细胞表达EPO。 IMDM 细胞培养基。 IMDM 是由Iscoves 改良的Eagle 培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。 RPMI-1640 细胞培养基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park

21、 Memorial Institute 研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS21种氨基酸维生素11 种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。 Fischers细胞培养基。用于白血病微粒细胞培养。 HamF10、F12 细胞培养基。 1963 年、1969 年由Ham 设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12 适用于CHO 细胞。DMEM/F12细胞培养基。 DMEM 和F12 细胞培养基按照 1:1 比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 （2）低血清细胞培养基 主要应用于VE

22、RO 细胞、BHK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。（3）无血清培养基 是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。 （4）替代天然培养基 培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。面对如此多的细胞培养基，对细胞培养基的选用，建议：可以查阅相关文献，或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株的培养基，或购买相配套的细胞培养基产品。 许多培养基都适合多种细胞株的培养，可以采用现有的培养基进行试验。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 1640；进行细

23、胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。结合细胞特性及培养基的培养效能，用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、克隆形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基。注：目前也有不少商业化的msc培养基，如百恩维的间充质干细胞无血清培养基，间充质干细胞培养基（低血清）7如何维持培养液 p H配好的培养液变碱（变紫红）是正常的现象。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，培养液中的HCO3 -被渐渐耗掉，培养液的pH值也逐渐升高，变成了紫红色。如果培养基pH值偏碱的程度不大，可将装培养液的瓶口拧松，放置于二氧化碳培养箱中一段时间，让培养箱中的CO2进入培养液，pH值就可以

24、纠正。如果pH值偏离的程度很大，可以通过添加少量无菌的H Cl 或者NaOH调节pH，便可以使用。将配制好的培养基小剂量分装，可以避免反复开盖引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同时因NaHCO3遇热不稳定，会分解释放出CO2 ，而使培养基的pH升高，偏碱。因此在配置使用培养的过程中应注意： （1）动作迅速，不可使培养液长时间处于较高室温下； （2）配置过程中，混匀时切不可加热。混匀后应立即放入4C 冰箱，待过滤时再取出； （3）使用完毕应尽快将瓶口封好，放于4C 冰箱保存。通过在培养液中同时添加Hepes 也可以有效的稳定pH 值。Hepes （羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液,

25、它在pH 7.27.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH 值。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。该缓冲液使用的终浓度为1050mmol/L，一般培养液内含20mmol/L Hepes 便可达到缓冲能力。Hepes 的使用方法有以下两种：（1）Hepes 可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中，再过滤除菌。每1000ml 培养液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 调pH 至7.2，过滤除菌后使用。此时HEPES 的使用浓度为10 mmol/L。（2）配成 100x 贮存液（1 mol

26、/L），使用前取 99mL 培养液加入 lmL 贮存液，最终应用浓度仍为 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 贮存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 双蒸水中，用1N NaOH 调pH 至7.58.0，然后用水定容至100mL，过滤除菌，分装小瓶（2mL/瓶），4或-20保存。8血清与干细胞的培养干细胞在体内存在的量很少，处在一个个环境相对稳定的“niche”中，所以一旦完成分离进入体外环境，最重要的就是保证细胞的活力不受影响，那么就必须提供一个相对稳定的培养环境。这些环境就是靠培养基和培养箱来提供了。培养液中最重要的莫过-血清，特别是对干细胞来说。所以

27、为了最优的干细胞培养效果，推荐选用对应的干细胞专用血清。牛血清是最常用的，但是根据血清的来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生1030 天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，所以也成为了干细胞培养的首选。 培养中如何正确的使用血清？避免不好的影响呢？血清的浓度：对大部分的干细胞，最佳的血清浓度是10%。过高的血清浓度会导致细胞出现分化的现象，如果是需要高浓度的血清，培养的时间也不能超过两周，否则会导致细胞分化能力下降。过低的血清会导致

28、细胞的增殖速度下降。血清的溶解：必须在 4进行，最好过夜溶解。这样可以减少沉淀的产生，避免营养物质的流式。同时也要避免血清的过滤，如果需要过滤可以和培养基一起过滤。细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次

29、的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。注意以下几点：（1）需要长期保存的血清必须储存于-20或-80低温冰箱中。4冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。（2）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 或 -80 低温冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20 进入37解冻，这样因温度改变太大，容易造成

30、蛋白质凝集而出现沉淀。影响使用效果！（3）热灭活是指56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement ）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。（4 ）切勿将血清在 37放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破坏而影响血清质量。（5）血清中的沉淀物 絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物

31、不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。9胎牛血清（F B S ）是否需要灭活灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒害作用。胎牛血清（FBS）对许多细胞系均有促生长作用，主要适用于细胞株的保藏及特殊用途的细胞株的体外培养。胎牛血清是取自剖腹产的胎牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少，质量是最高的。所以不必要灭活。10细胞的细菌、真菌污染及排除

32、真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细菌是一种原核细胞微生物，

33、其大小以微米（m）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取 10ml 细胞悬液以 100rpm 离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37培养，24h 可得结果。污染后

34、细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗， 最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜11细胞培养污染的预防溶液处理（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重

35、新得到，可采用510 倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用2448h，再换入常规培养液，有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。 常用抗生素用量和效应 抗生素 抗菌谱 浓度（量/mL）细菌 真菌 支原体 青霉素 G+ 1001000g链霉素 G- 1001000g庆大霉素 G+ /G- + 50200g四环素 G+ /G- + 1050g卡那霉素 G+ /G- + 1001000g两性霉素 + 常用2g/mL制霉菌素 + 常用25g/mL+表示效应程度 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生

36、素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 （1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 （2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。 （3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 （4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23 代。（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 （6）重复步骤4 。

37、 （7）在无抗生素的培养基中培养46 代，确定污染是否以已被消除。12使用胰蛋白酶时加入 E DTA的目的是什么体外培养的细胞受到严重污染时，有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此，防止污染，预防是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的始终，才能将发生污染的可能性降到最小程度。 一般预防可从以下几方面着手： （1）添加抗生素 各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好（但迄今尚无对抗支原体特效抗生素）。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。（

38、2）从物品、用品消毒灭菌着手 细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml 的饱和硫酸铜加3L 灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。 （3）从操作者做起 进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用 75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。 操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或

39、封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。 操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污

40、染。 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。（4）防止细胞交叉污染 所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。（5）无菌室的彻底消毒新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭 500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量

41、的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含3740%的甲醛。13胶原酶的种类和选型在细胞的取材中，各种消化酶经常用于组织的分散，在组织中取得目的细胞。例如脂肪间质干细胞（ADSCs ）、软骨细胞培养等。其中胶原酶是最常用的一种。种类：I-IV 型选择：结缔组织I，III 型；骨组织、脂肪组织I 型；软骨组织II 型；胰岛细胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增强胶原酶的消化能力，对细胞损伤最小。14胶原酶 V S胰酶胰蛋白酶（T

42、rypsin ），简称胰酶，可使细胞间的蛋白质水解从而达到细胞离散的目的，是目前应用最为广泛的消化剂，主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶适用于细胞间质较少的软组织（如胚胎、上皮、羊膜、肝、肾等软组织）及传代细胞的消化，但对于纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.10.25%浓度，常用0.25%，特别敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、温度、胰酶的浓度、组织块的大小和硬度有关。胰酶作用及溶解的最佳pH

43、是89，配制胰酶溶液可将液体调至pH8 左右，充分溶解，过滤除菌，过滤后再调至pH7.4 左右。胰酶作用的最适温度为37，在夏季室温25以上对一般传代细胞也能达到消化效果。一般新鲜配制的胰酶消化能力较强。消化时间要根据不同的情况而定，胰酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说，温度低，组织块大、胰酶浓度低者，消化时间长，反之则相应减少时间。酶的浓度过大或消化时间太长，会导致消化过度，对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，被消化掉；消化时间太短，消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性，也达不到分散细胞的目的。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的

44、活性（配制条件、冻存或 4保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶进行消化时，可改变不同参数以确定出最佳消化效果。胰酶的配置方法： （1）称取胰酶：按胰酶液浓度为0.25 ，用电子天平准确称取粉剂溶入PBS 或D-hanks 中，低速搅拌34小时或者置于 4过夜混匀（低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫严重，有可能导致酶的变性）。（0）调节pH 值为7.4 左右。用注射滤器过滤除菌，因蛋白制剂不宜4长期保存，忌反复冻融，建议分装成小瓶（离心管）于-20冻存或置4保存备用。注意事项：是否需要

45、4放置过夜，取决于胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要4过夜。而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要4过夜。从理论上来说，4放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以除去细菌，但除不掉其代谢产物。 如果胰酶不溶、有絮状物，考虑可能的原因有：胰酶过期或是已经部分变性；溶液 pH 值不对；在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可。Ca2+、Mg2+、血清和蛋白质对胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、这些离子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 来配制。正是这个道理，开始消化前，需用PBS 将培养液冲洗干净后方加入胰酶进行消化

46、，否则会大大影响胰酶的作用效果。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，将胰酶与EDTA （乙二胺四乙酸）混合来进行消化。EDTA 可通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞连接从而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS 彻底冲洗培养瓶（板），使得更好的再次利用培养瓶（板），否则再培养时可能会导致细胞容易脱壁。 EDTA在常温下难溶于酸，微溶于水（20时溶解度只有 0.02g ），但在碱性溶液中溶解性较大。因此为了更快的溶解 EDTA 可采取调节 PH或

47、者是加热的办法。但须注意：由于胰酶不耐高温，因此待EDTA溶解后，温度有所下降才能加入胰酶。如果是单独配置 EDTA 溶液，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。胶原酶（collagenase ）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度200U/ml （约为1mg/mL ）或0.03%0.3%。胶原酶分为、型以及肝

48、细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。具体可见胶原酶的种类和选型。胶原酶消化缓和、无须机械振荡，因而可进一步提高细胞成活率，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的配置胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。关于胰蛋白酶配置方法可见：胰蛋白酶消化法。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用 BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培养液配制。 胶原酶的使用： （1）将漂洗、修剪干净的组织剪成12mm3左右小块（2）将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入3050

49、 倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。 （3）将烧瓶放入37水浴或者37孵箱内，每隔3min 振摇一次，如能放在37的恒温震荡水浴箱中则更好。消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间448h，对于容易消化的组织可以采用37震荡消化 1545min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。 （4）收集消化液（有时含个别组织块及

50、没有充分消化的组织碎屑则需用 100 目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者无血清培养液离心漂洗12 次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。胶原酶Vs 胰蛋白酶 胰蛋白酶和胶原酶消化时间与浓度上的差异，依消化温度而异。另外这两种酶也可混合应用，浓度为：胰蛋白酶0.1mg+胶原酶0.25mg/mL。两酶相比的差别见表1 和表2。 表1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别 项目 胰蛋白酶 胶原酶消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多的组织用量 0.01%0.5% 0.10.3 mg/mL（200 U/mL）消化时间 0.5 2h 1 12hp

51、H 89 6.57.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清抑活 有 无Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响表2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块（0.51cm3 ）时所需时间（h） 酶种类和用量 较硬组织 软组织4 室温 37 4 室温 37胰蛋白酶（0.25%） 2448 16 12 1224 12 0.51胶原酶（1200 U/mL） 24 6 0.5 12 3 0.25胰蛋白酶（0.25%）+胶原酶（200 U/mL） 1246 1224 412 1224 612 1215干细胞的种类和表面标记通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：SH2、SH

52、3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干细胞，骨髓中绝大多数是HSC，BMSC 只占骨髓有核细胞的0.001%0.01% 。因此鉴定BMSC 的方法是在骨髓的干细胞中排除HSCBMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。16间质干细胞培养原理概述间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可分化成多种组织细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。间质干细胞最早是从骨髓

53、中分离得到的，正常情况下，它在骨髓中的比例非常低，仅占单核细胞的1/105 1/104 。骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090 g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.0751.090 g/ml，血小板为1.0301.035 g/ml。为此利用一种密度介于1.0751.092 g/ml之间而近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。在骨髓的原代培养物中，除了贴壁生长的成纤维细胞样的间质干细胞外，还混杂着一

54、些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的间质干细胞，必须除去其他细胞。根据其他细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去。对于贴壁的单核巨噬细胞，可根据其黏附能力的不同，通过调整Trypsin/EDTA 的消化时间，保证间质干细胞在短暂的作用时间内与塑料培养瓶壁分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁，从而使间质干细胞与其他的贴壁细胞得到分离。在传代培养中，接种密度是影响体外培养间质干细胞增殖潜能的重要因素。低密度接种时，间质干细胞的增殖能力明显提高，而诱导细胞分化时则需要较高的细胞密度，这可能与分化时细胞与细胞间的相互作用有关。

55、而在培养过程中，若细胞过度融合会促进其分化趋向，故要保持干细胞未分化状态，要及时传代。17间质干细胞成脂和成骨诱导分化成骨和成脂诱导是鉴定干细胞的一种重要的方法，也是最常用、报道见得最多的方法。成骨最常用的染色方法是茜素红染色（碱性磷酸酶），成脂诱导最常用是Oil Red O （油红O）染色法。下面我介绍一下这两种染色方法的原理和步骤。 茜素红染色方法和原理：成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，这就是我们常说的“钙结节”。鉴定钙结节的染色方法常用“茜素红”。 步骤： （1）吸去诱导液，再PBS 洗一到两次；（2）加入10中性甲醛，固定30min-60min；（3）吸去固定液，加入

56、0.1%的茜素红染色液，染色6-10min；（4）用PBS 洗两次，去处残留的染色液；（5）加入PBS，完成染色； 茜素红：茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。橙黄色或黄棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 为2.15，其水溶液呈浅黄褐色，加盐酸后变成黄色，加氢氧化钠后则变成蓝紫色。有刺激性。能与许多金属离子生成带色化合物，能与锆、钍、铝、钛及铍和钙的显色反应。染色的原理就是茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。Oil Red O（油红O）染色的方法和原理：成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。Oil Red O染色的方法是对油滴的染色的一种方法。 步骤： （1）吸去诱导液，再PBS 洗一到两次；（2）加入10中性甲醛，固定60min； （3）吸去固定液，加入现配和过滤后的Oil Red O 染色液，染色60min； （4）用PBS 洗2-5 次，去处残留的染色液和残渣； （5）加入PBS，完成染色； Oil Red O（油红O）：1-2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯