自由基损伤学说及抗氧化剂

1、自由基损伤学说及抗氧化剂,1,铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于氧化变黑。人的机体与金属一样也会受到氧化而导致“生锈”，罪魁就是自由基,2,1956 年英国分子生物学家Harman 首次提出： “氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说， 认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。 Harman, D. J. Gerontol. 1956; 11: 298-300,氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集, 从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态,3,生成增加，消除减少,Physiol Rev. 2002; 82: 4795,4

2、,Free Radical Biology 25:29-38,24,NADPH Oxidase Acitvity,O2.,NADPH氧化酶与动脉粥样硬化,25,氧化应激与高血压,26,自由基的信号转导途径,27,氧自由基参与信号转导通路,EGF Receptor Protein Tyrosine Phosphatases Insulin Receptor Kinase Activity Cytoplasmic Protein Kinases MAPK Cascades Protein Kinase C Isoforms Cytosolic Ca2+ Concentrations Transcr

3、iption Factor,28,Role of ROS in EGF Receptor-Mediated Signalling,29,MAPK信号级联反应,Stimulus,Growth factors, Mitogen, GPCR,p38 MAPK,Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth factors,Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR,MEKK1, 4, MLK3, ASK1,MEKK2, 3, Tpl2,MLK3, TAK, DLK,Raf, Mos, Tpl2,MKK3/6,MEK1/2,MK

4、K4/7,MEK5,ERK1/2,MAPKKK,Growth, Differentiation, Development,Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation,Growth, Differentiation, Development,ERK5/BMK1,JNK1,2,3,MAPKK,MAPK,Biological responses,自由基的检测,31,化学发光法,检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。 检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2 和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。 优点：灵敏、快

5、速、操作简单、价格低廉。 缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常强的化学发光,32,二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE,检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法,33,Circulation. 2008;117:1045-1054,Determination of ROS by DHE Staining,

6、34,检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan) 。并发出450nm的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的超氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长，并需要新鲜组织样本,Lucigenin (光泽精)-Enhanced Chemiluminescence,35,Determination of ROS by Lucigenin-Enhanced Chemiluminescence,36,检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而

7、使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平,2, 7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA,37,Br J Pharmacol. 2008;154(1):105-13,Determination of ROS by DCFH-DA Staining,38,39,40,41,影响自由基的药物,43,影响自由基的药物,抗氧化药物 促氧化药物“以毒攻毒,44,抗氧化药物,维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维生素A、GSH等； 活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、Co-Q类等； 化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、2受体激动药及阻断药等； 中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含的黄酮类、酚类、多糖类等,45,46,化学性直接产生自由基及活性氧； 通过作用于机体防御机制，促进机体内自由基、活性氧产生。巨噬细胞、中性粒细胞在对侵入机体的抗原通过吞噬