folin酚试剂法测定蛋白质含量

1、Lowry,s,法,Folin,酚试剂法,测定蛋白质含量,Determination of protein content by,Lowry,s method,南方医科大学,生物化学与分子生物学实验教学中心,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验目的,掌握,Folin,酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其,实验操作技术,掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品,溶液中待测定物质含量的方法,生物化学与分子生物学实验教学中心,选择测定方法时应考虑,实验对测定所要求的灵敏度和精确度,蛋白质的性质,溶液中存在的干扰物质,测定所花费的时间等,生物化学与分子生物学实验教学中心,本法概述,1921,年,Fol

2、in,首创，利用蛋白质分子中酪氨酸,和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸,磷,钼酸）起蓝色反应,1951,年,Lowry,对此法进行了改进，先于标本中加,碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度,生物化学与分子生物学实验教学中心,什么是双缩脲反应,两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲,H,2,N-OC-NH-CO-NH,2,因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与,Cu,2,发,生双缩脲反应,生成,紫红色络合物,生物化学与分子生物学实验教学中心,原理,1,第一步：双缩脲反应,蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键,CO-NH,，同样能,在碱性条件下与,Cu,2,发生双缩脲反应，生成的,紫红色络合

3、物,蛋白质,Cu,2,复合物,且在,540nm,处的吸光度与蛋白质的,含量在,10,120g/L,范围内有良好的线性关系,生物化学与分子生物学实验教学中心,原理,2,第二步,Folin,酚显色反应,Folin,酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸,盐,磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈,蓝色反应,钼蓝和钨蓝的混合物,由于蛋白质中含有带酚羟,基的酪氨酸,Tyr,故有此显色反应,即,蛋白质,Cu,2,复合物,中所含的酪氨酸残基,还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成,蓝色的化,合物,生物化学与分子生物学实验教学中心,原理,3,在一定浓度范围内,蓝色,的深浅度与蛋白质,浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标

4、准液,比色即可求出蛋白质的含量,即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中,蛋白质的含量,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验材料,样品,健康人血清,正常人血清蛋白质含量,60,80 g/L,试剂,1,牛血清白蛋白标准液,200g/ml,2,碱性硫酸铜溶液（当日有效,3,Folin,酚试剂,仪器与器材,1,V-1100,分光光度计,2,恒温水浴箱,3,试管,6,支、试管架,4,加样枪、加样枪架,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤,取,6,支试管，做好标记，按下表顺序操作,加入物,ml,1 2 3 4 5,6,牛血清白蛋白标准液,0.20 0.40 0.60 0.80,样品液,300,倍稀

5、释,- - -,0.50,蒸馏水,1.0 0.80 0.60 0.40 0.20,0.50,碱性硫酸铜溶液,2.0 2.0 2.0 2.0 2.0,2.0,各管蛋白浓度,ug/ml,0 40 80 120 160,未知,各管混匀，室温放置,10min,向各管内加入,Folin,酚试剂,0.20ml,2s,内迅速混匀,40,放置,10min,冷却至室温后，以,500nm,波长比色，用,1,号管,作空白，读取各管吸光度,生物化学与分子生物学实验教学中心,注意事项,1,Folin,酚试剂,在酸性条件下较稳定,而碱性硫酸,铜试剂是在,碱性条件,下与蛋白质作用生成碱性的,铜,蛋白质溶液,故当,Folin

6、,酚试剂加到碱性的铜,蛋白质溶,液中后,必须立即混匀,加一管混匀一管），使,还原反应发生在磷钼酸,磷钨酸试剂被破坏之前,生物化学与分子生物学实验教学中心,注意事项,2,因,Lowry,反应的显色随时间不断加深，因此各项操,作必须精确控制时间,即第,1,支试管加入,2.0mL,碱性硫酸铜试剂,后，开始计时,1,分钟后，第,2,支试管加入,2.0mL,碱性硫酸铜试剂,2,分钟后加第,3,支试管，以此类推,全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到,10,分钟，则第,1,支试管可立即加入,0.20mL,Folin,酚试剂,1,分钟后第,2,支试管加入,0.20mL,Folin,酚试剂,2,分钟后加第,3,支

7、试,管，以此类推,水浴,10min,冷却后，每一分钟测一管,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验数据记录表,测定次数,各,管,A,值,1 2 3 4 5 6,1,2,3,用各管平均,A,值绘制标准曲线图,生物化学与分子生物学实验教学中心,绘制标准曲线步骤,1,选择合适的坐标纸,2,画坐标轴,3,根据测得的数据描点,4,连线,5,求实验结果,生物化学与分子生物学实验教学中心,绘制标准曲线,1,以,A500,值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标,用铅笔绘制标准曲线,吸,光,度,A,蛋白质浓度,C,g/ml,0.2,0.4,0.6,40,80,120,160,要写图题,生物化学与分子生物学实

8、验教学中心,绘制标准曲线,2,根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲,线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线,不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实,验点均匀分布在曲线或直线两侧,生物化学与分子生物学实验教学中心,结果计算,根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准,曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量,然后乘以稀释倍数,300,，得出每毫升未稀释血,清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的,微克数(g/ml,血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度,2,300,最后浓度单位换算成,g/L,生物化学与分子生物学实验教学中心,本方法的特点,优点,1,灵敏度高，比双缩脲法灵敏约,100

9、,倍,2,操作简单，不需特殊仪器设备,缺点,1,费时间较长，要精确控制操作时间,2,标准曲线也不是严格的直线形式,3,专一性较差，干扰物质较多,生物化学与分子生物学实验教学中心,复习思考题,1,试述,Folin,酚试剂法的优点,2,应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何,注意,请将答案附在实验报告上,生物化学与分子生物学实验教学中心,值日生工作,实验完毕，组长登记实验室使用记录,关闭仪器电源,清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾,回收试剂：将血清,Folin,酚试剂、牛血清白蛋白标准液,试剂收回放至准备室冰箱,碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干,净，将试剂瓶放至准备室,生物化学与分子生物学实验教学中心,V-1100,分光光度计操作步骤,开机，预热,30,分钟,转动波长旋钮，调所需波长。按,键切换到,T,档,将黑体放入光路中，合上盖，按,键校零,开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上