宫颈癌细胞MFGE8表达与生物学的相关性

1、宫颈癌细胞MFGE8表达与生物学的相关性目的探讨宫颈癌细胞乳脂肪球表皮生长因子8蛋白(MFGE8)表达与生物学行为的相关性。方法Si-Ha细胞分为三组:对照组、实验1组与实验2组，对照组不进行转染，实验1组与实验2组分别转染siNA1-MFGE8与siNA2-MFGE8，采用实时荧光定量PC检测MFGE8mNA表达，Westernblot检测MFGE8蛋白表达，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡。结果转染24h与48h后，实验1组与实验2组的MFGE8mNA与蛋白相对表达水平、细胞增殖指数都低于对照组(P005)，细胞凋亡指数显著高于对照组(P005)，实验1组与实

2、验2组之间对比差异无统计学意义(P005)。转染后48h，三组的细胞G1、S、G2/M期对比差异都无统计学意义(P005)。结论宫颈癌细胞中MFGE8表达呈现高表达情况，抑制MFGE8能抑制宫颈癌细胞的增殖，促进其凋亡，但是对细胞周期无显著影响。宫颈癌;乳脂肪球表皮生长因子8蛋白;生物学行为;相关性宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，宫颈癌在我国的发病率逐年增加，严重威胁女性的身心健康1。高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)的持续感染是宫颈癌的主要诱发因素，至少80%左右的宫颈癌患者在病程进展中存在生殖器HPV感染2-3。乳脂肪球表皮生长因子8蛋白(milkfat

3、globuleEGFfactor8，MFGE8)作为1种分泌性糖蛋白，在巨噬细胞、内皮细胞、肌上皮细胞、树突状细胞等都有广泛分布4。MFGE8在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，其表达分布与病程长短密切相关，可能成为判断肿瘤患者预后的特异性指标5-7，但是在宫颈癌中的应用还无相关报道。本文具体探讨了宫颈癌细胞MFGE8表达与生物学行为的相关性，希望可丰富对宫颈癌致癌分子机制的认识，并为发现宫颈癌治疗的新靶点提供一定的基础。现报告如下。1材料与方法11实验材料SiHa细胞株由本实验室保存，其为宫颈癌HPV16阳性的鳞癌细胞，培养条件:10%胎牛血清(美国Hy-Clone公司)+DMEM培养基(美国

4、HyClone公司)，37、5%培养箱。025%胰酶消化液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。12实验分组与处理根据NCBI数据库中MFGE8基因的序列设计si-siNA-MFGE8序列两条，交由上海吉玛公司合成。siNA1-MFGE8:5-ACAGAACACUCAUGGAUUATT-3(正链)，5-UAAUCCAUGAGUGUUCUGUTT-3(负链);siNA2-MFGE8:5-CGAGCACAAACGGAAACAAT

5、T-3(正链)，5-UUGUUUCCGUUUGUGCUCGTT-3(负链)。SiHa细胞分为3组:对照组、实验1组与实验2组，对照组不进行转染，实验1组与实验2组分别转染siNA1-MFGE8与siNA2-MFGE8。在转染过程中，配制细胞转染混合液，在6孔板(对数生长期且细胞状态良好的SiHa细胞)相应孔内依次加入500μl无血清培养基，5μlsi-NA转染试剂LipofectamineNAiMAX，混匀静置5min后再加入2μlsi-NA，在混匀静置20min。将细胞悬液按滴加入各孔，然后常规进行培养，培养6h后进行换液。13实时荧光定量PC检测MFGE8mNA表达使用T

6、aKaaSYBPremix试剂进行实时荧光定量PC反应，配置体系:2×mix50μl，正链引物05μl，负链引物05μl，模板20μl，灭菌水65μl，将混合液加入实时荧光定量PC8连排管中，每个样品设置3个复孔。14Westernblot检测MFGE8蛋白表达胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，收集细胞，加入预冷的IPA裂解液，冰上裂解30min，4，12000rpm，离心15min，取上清，即细胞总蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度，然后上样SDS-PAGE胶进行电泳，电泳后进行转膜，室温封闭3h后加入抗MFGE8抗体与抗β-actin抗体各2

7、μl(一抗稀释浓度11000)，4过夜;洗膜后加入二抗(稀释浓度110000)2μl，室温1h，然后进行ECL曝光，记录MF-GE8蛋白相对表达水平。15CCK-8法检测细胞增殖能力胰蛋白酶消化细胞并接种于96孔板中，每孔细胞数量大约为30004000个，每组细胞设置3个复孔。培养48h后向每孔加入10μlCCK-8工作液，振荡混匀后继续培养2h，使用酶标仪测定450nm处的吸光光度值，记录与计算细胞增殖指数。16流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡胰蛋白酶消化细胞并收集细胞，采用用100μl预冷的PBS重悬细胞，再加入500μl预冷的75%乙醇固定细胞，4放置12h

8、后采用流式细胞术检测细胞周期。在细胞凋亡检测中，用400μl1×AnnexinV结合液悬浮细胞，加入5μlAnnexinV-FITC染色体，混匀后4避光条件下孵育15min，加入10μlPI染色液后轻轻混匀于4避光孵育5min，采用流式细胞术检测细胞凋亡指数。上述所有实验都重复3次，取3次检测的平均值。17统计方法应用SPSS2200软件进行数据分析，计量数据以(x珋±s)表示，两两对比采用t检验、LSD方法，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=005，P005为存在统计学差异。2结果21MFGE8mNA与蛋白表达水平对比转染24

9、h与48h后，与对照组相比，实验1组与实验2组的MFGE8mNA与蛋白相对表达水平都显著降低(P005)，实验1组与实验2组之间对比差异无统计学意义(P005)。见表1。22细胞增殖指数对比转染24h与48h后，实验1组与实验2组的细胞增殖指数显著低于对照组(P005)，实验1组与实验2组之间对比差异无统计学意义(P005)。见表2。23细胞凋亡指数对比转染24h与48h后，实验1组与实验2组的细胞凋亡指数显著高于对照组(P005)，实验1组与实验2组之间对比差异无统计学意义(P005)，见表3。24细胞周期对比转染后48h，三组的细胞G1、S、G2/M期对比差异都无统计学意义(P005)，见

10、表4。3讨论宫颈癌是由于宫颈细胞的增生异常引起的恶性肿瘤，当前在我国年轻女性中的发病人数逐年增加，严重威胁着女性的生命和健康8。该病在发生发展过程中多伴随有异常的阴道出血、骨盆疼痛等症状，严重情况下可出现下腹部剧烈疼痛，导致无法下地行走等9。该病的高危因素比较多，包括机体免疫系统功能低下、HPV病毒感染、吸烟、长期使用避孕药等10-11。虽然HPV多价疫苗能够有效预防宫颈癌的发生，但是在临床上的普及仍存在很大问题，为此早期分析宫颈癌的发生机制具有重要价值12。MFGE8是1种存在于多种物种乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白，主要由胆固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂构成，主要由分化的乳腺上皮细胞合成，然后

11、经膜包被分泌人乳导管腔13。MFGE8在乳腺癌细胞中发现MFGE8的分泌量显著提高，可通过辨认暴露于凋亡上皮细胞表面的丝氨酸与凋亡的上皮细胞结，从而加快对凋亡细胞的清除14。MFGE8在恶性肿瘤的高表达还可抑制病毒的表达，促进凋亡上皮细胞的清除，从而促进肿瘤细胞的快速增殖与转移15。本研究显示转染24h与48h后，实验1组与实验2组的细胞增殖指数显著低于对照组，细胞凋亡指数显著高于对照组，实验1组与实验2组之间对比差异无统计学意义，表明抑制MFGE8的表达能抑制宫颈癌细胞增殖与促进细胞凋亡。从机制上分析，MFGE8可以通过调节NF-kB、P53等多种转录因子与DNA的结合能力，加快血管内皮生长

12、因子的表达量，从而促进肿瘤细胞快速增长16。并且MFGE8可通过促使DNA前体合成、抑制由细胞黏附促发的应激信号等多种途径促进肿瘤细胞的增殖及生长17。当前在临床上主要采取手术、放疗和化疗等手段对宫颈癌进行治疗，但是很难持续改善患者的预后18。而无论是抑癌基因还是癌基因，均是细胞中的正常基因，二者共同调控细胞的分化、凋亡、周期、增殖等生物学行为，当癌基因过度表达或者抑癌基因表达被抑制，都会导致细胞的异常增殖与分化，也会导致细胞周期失控19。本研究显示转染后48h，三组的细胞G1、S、G2/M期对比差异都无统计学意义，表明抑制MFGE8的表达对宫颈癌细胞的细胞周期无显著影响。当前有研究显示MFGE8的高表达通过结合肿瘤细胞膜上磷脂酰丝氨酸，促进细胞向前移动爬行，导致细胞的形态及骨架结构发生改变，从而加速细胞的侵袭，并且还通过增强对抗癌药物的耐药作用影响患者的预后2