蛋白质和氨基酸的测定

1、第十章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述,一）蛋白质组成与分类 1. 组成Composition 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。 元素组成百分比：元素 C H O N S P 百分比 50 7 23 16 0-3 0-3 一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%，所以在用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮%乘上蛋白质的换算参数K=6.25即为该物

2、质的蛋白质含量,2.按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类： 完全蛋白质：这是一种质量优良的蛋白质，含有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中的酪蛋白、大豆蛋白及小麦中的麦谷蛋白等，都是人体所必须的完全蛋白质。 半完全蛋白质：此类蛋白质中，所含必需氨基酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又不合适。如果在膳食中以它作为唯一的蛋白质来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白,不完全蛋白质：这类蛋白质中所含必需氨基酸的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋白质来源，既不能促进机体的生长发

3、育，也难以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮中的胶原蛋白等。 3.食品中蛋白质的氨基酸组成 上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，按照-氨基酸侧链R基团的结构可分为,脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。 羟基类：丝氨酸、苏氨酸 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸 酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺 含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸 芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 亚氨基酸：脯氨酸,在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨

4、酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠从食品摄入，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能。 限制氨基酸：是指食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或数量不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋白质的过程受到限制，亦即限制了此种蛋白质的营养价值，这类氨基酸就称为,按易缺少数量多少的顺序排列，称为第一限制氨基酸、第二等等。如大豆第一限制氨基酸为蛋氨酸。大米第一限制氨基酸为lys，第二限制氨基酸为thr. 评价某种蛋白质的营养价值包括两个方面：一是各种必需氨基酸含量是否丰富，二是必需氨基酸的构成是否符合一定比例,二）各种食品中蛋白质的含量及测定意义 1.含量

5、由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含蛋白质最高。 如黄豆蛋白质含量在40%。 牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右， 猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20% ， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%， 苹果 1.4,2.测定意义 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有及其重要的意义。 蛋白质 是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健

6、康。如果膳食中蛋白质长期不足，将出现负氮平衡，也就是说每天体内的排出氮大于抗体摄入氮，这样造成消化吸收不良导致腹泻等。但是摄入量过多会引起机体肝、肾病变,二.蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即利用含氮量，肽键等测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。 但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分如碳水化合物，脂肪和维生素等干扰成分很多，故蛋白质的测定最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和

7、微量法，但它们的基本原理都是一样的,鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法测定。 色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控制进行自动检测和计算，也可以快速、准确的测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法,第二节 蛋白质的定量测定关于氮-蛋白质换算系数 对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历来采用6.25，这个数值是以蛋白质平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食

8、品种类不同，差别是很大的，我们在测定蛋白质时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。 对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的原料为换算系数，对于一些组成成分不明确的食品可采用6.25，我们在作实验报告时，一定要注明所用的换算系数,一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良

9、凯氏法,可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。这里只介绍前三种。 （一）常量凯氏定氮法 1. 原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，将有机物炭

10、化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫： 2H2SO4 +CCO2+2SO2+2H2O 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾（1689 ）之后可以提高至400以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下： K2SO4 +H2SO4 =2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O+SO

11、3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失： （NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO4,2（NH4）HSO4 NH3+SO3+H2O 也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。硫酸铜的作用机理如下： C+ 2CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+22SO4 2CuSO4 +SO2+2H2O,此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜生成（褐色），溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一

12、步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一般说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再加入,仪器：凯氏消化装置。100页 要防止爆沸。 幻灯片 21,2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。幻灯片 22,3. 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂，国标用亚甲基兰+甲基红）。 指示剂 紫红色

13、 绿色 淡紫红 （酸） （碱） （酸） 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。（pH4.86.0 红 黄,吸收,滴定,操作步骤： 准确称取固体样品0.20-2.00g（半固体25g，液体样品1020ml）于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4轻轻摇匀后连接消化装置，在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化至到样液呈蓝绿色透明时再消化30分钟，停止消化，冷却加200ml水幻灯片 18,连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在K氏

14、烧瓶中加玻璃珠数粒和80ml40% NaOH摇动凯氏瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再加入100ml蒸馏水，夹紧夹子加热蒸馏至氨全部蒸出（馏出液约250ml即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热用0.1M HCl滴定至蓝色变为微红色即为终点。 2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气,奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4） 检验NH4+离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制 方法1- 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/

15、L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。 方法2- 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中,下面针对几点来说明影响氨化完全和速度快的因素 （1）K氏烧瓶和取样量 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，8001000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。 （2）分解剂 A H2SO4和K2SO4的添加量 有机物分解需要的H2SO4量应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K

16、2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分,K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的 还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10g：20ml B 催化剂 用作催化剂的有Hg、HgO、Se、CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但效果好，Se与CuSO4效果相似，TiO2的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型,3）热源的强度 消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便K2SO4

17、加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏烧瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关,4）氨的蒸馏和吸收及滴定 蒸馏加NaOH是40%，加的量为H2SO4量的3倍，硫酸量为20ml，则NaOH为203=60ml，而且一般高于这个理论值，即加到7080ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。 吸收液有：1标准H2SO4 用标准碱反滴定，甲基红指示剂 2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示

18、剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用4,结果计算：101页 注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25 也可查表。 说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全,样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明

19、时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量,般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸,二、微量凯氏定氮法,1、

20、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 凯氏烧瓶100ml 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见 102 页图 5-9,10-2,5-9,4.说明： 蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。 蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。 加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。 2硼酸吸收液每次用量为25ml，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴,三、自动凯氏定

21、氮法,1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样,半自动凯氏定氮仪,第三节 蛋白质的快速测定法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但除自动凯氏定氮法外，均操作费时，且有环境污染，影响操作人员健康。 为满足生产单位对工艺过程的快速控制分析，尽量减少环境污染和操作简便省时，因此又陆续创立了不少快速测定法。 包括双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸

22、比色法等,一.双缩脲法 1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩和成双缩脲,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键（ CONH），与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm,NH2CONHCONH2 + NH3,注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化,2.方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等

23、样品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/m in） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液,甘油作为稳定剂：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时慢慢加入50ml4%CuSO4。 酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。 (2) 四氯化碳,5操作方法：标准曲线绘制 准确称0.6g样品使用试剂 准确称0.5g样品使用试剂 假如用试剂 （1）标准曲线绘制 按凯

24、氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中分别加水定容，在560nm波长下测定其吸光度。 以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线,2）准确称样0.5g于80ml离心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸钾钠稳定剂盖上盖子离心10min（4000转/分）放置1小时吸混合液15ml于20ml离心管中离心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量,4 计算：蛋白质%=（C/W）100 C-从标准曲线上查得得蛋白质含量（mg） W-测定样液

25、时相当于样品重量（mg） 三紫外吸收法 1原理：利用蛋白质的特有基团,在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与蛋白质浓度（38mg/ml）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量,2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3主要仪器： 紫外分光光度计 离心机（3000 5000 r/min） 4操作：（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，

26、以每分钟30005000转的速度离心10分钟，分别吸取上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶各加入8mol/l脲的氢氧化钠溶液至标线，充分摇2分钟（如果混浊再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值,以事先用凯氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横坐标，上述的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 （2）样品测定 准确称取试样1.00g于50ml烧杯中加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml搅拌10分钟四层纱布过滤到离心管中用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的含量。 计算：

27、蛋白质= （C/W）100 C-从标准曲线上查得的蛋白质含量（mg） W-测定样品溶液相当于样品量（mg） 说明：a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在2030,四.水扬酸比色法： 1.原理： 样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有蓝色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。 2.方法 （）标准曲线的绘制 取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6 分别加空白酸液 2ml 分别加磷酸盐缓冲液 5ml 稀释至总体体

28、积至 15ml 分别加水扬酸钠 5ml 37C水浴 15分钟 加入次氯酸钠 2.5ml 37C水浴 15分钟 取出加水至标线，于660nm下进行比色测定，绘标准曲线,2）样品处理： 准确称样0.201.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾后加大火力消化直到出现暗绿色时摇动瓶子K氏瓶全部消化后冷却加水至250ml容量瓶。 （3）样品测定： 准确吸取上述消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容准确吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同 并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。 （4）计算 CF 含氮%= - 1

29、00 W10001000 C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（g） F-样品溶液的稀释倍数 W-样品重量（g） 蛋白质%=总氮%K（K可为6.25，也可查,第四节 氨基酸总量测定 蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分， 如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成 蛋白质最基本的物质。 水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性，化学结 构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的 程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程 度，也就可以评价食品的营养价值。 氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测 定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于

30、食 品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中,所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸 百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基 酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含 有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含 氮量计算出氨基酸的含量。 食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定 蛋白质的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨 基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基 酸进行定量定性分析,一氨基酸的一般定量测定（一）双指示剂甲醛滴定法,1.原理：氨基酸本身有碱性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，它们相互作用而生成中性内盐，加入甲醛溶液后，与 NH2 结合，碱性消失，再用强碱来

31、滴定 COOH 基。 2特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品中游离氨基酸的测定,3双指示剂： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性红 50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4操作： 取相同两份样品2030mg分别于250ml三角瓶各加50ml蒸馏水 一份加中性红3滴用0.1mol/L NaOH滴定终

32、点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml摇匀用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数,5.计算： 氨基酸态氮= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积 V2用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol。 （二）茚三酮的比色法 1. 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm,2.试剂： （1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下： 称磷酸二氢钾4.5350g。溶解定容至500ml 称NaH2PO412H2

33、O 11.9380g，溶解定容至500ml 取上述配好的磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液。 （2）2%茚三酮溶液： 称茚三酮1g溶于35ml热水加入40mg氯化亚锡（SnCl2H2O）搅拌过滤（作防腐剂）于冷暗处过夜定容50ml,3） 氨基酸标液 称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml摇匀吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200g/ml标液 3操作方法： （1）绘制标准曲线： 取7个25ml容量瓶，吸取标液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓

34、冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线,2）样品测定： 取样品5.0010.0g（液体样5-10ml）于烧杯中加50ml水和活性碳约5g加热过滤用3040ml热水洗涤活性炭吸澄清样液14ml加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量,氨基酸含量（毫克/100克）=C100/（m1000） C从标准曲线上查得得氨基酸的量（g） m 测定得样品溶液相当于样品的量（g） 注意事项： 茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下

35、：取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用,第五节 氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等,一）原理： 取一定量经水解的样品溶

36、液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量,Rf = a / b,a,b,样点,溶剂前沿,点样原点,优点： 展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100倍） 精确到0.01ug。 也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等,三）操作方法： 薄层板制备：p111 样品液制备 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原