DR突变对细菌视紫红质光循环后半程M态和N态的影响

1、D38R突变对细菌视紫红质光循环后半程M态和N态的影响第52卷第6期2006年12月武汉大学(理学版)J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.)V01.52No.6Dec.2006,745750文章编号:16718836(2006)06074506D38R突变对细菌视紫红质光循环后半程M态和N态的影响王友亮,金卫华,曹军卫,姚保利,雷铭(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉430072;2.中国科学院西安光学精密机械研究所/瞬态光学与光子技术国家重点实验室,陕西西安710068)摘要:用重叠PCR的方法,定点突变细菌视紫红质(bacteri0rhodopsin,BR),克隆到单突变体BR

2、和双突变体BRmN的基因,同源转化盐沼盐杆菌(Halobacteriumsalinarium)I33(BR),表达突变蛋白BRDg6N和BR.,通过显微视频方法对突变BR的M态光致变色特性进行记录,BRD38R/的M态寿命为5S,约为BR.(M态寿命为3s)的1.7倍.对突变体的激光共聚焦拉曼光谱测定发现,在BRm.中,1170cm一下移到1171cm,1258CEll上移到1255cm,而BRD佃6N中1170cm下移到1173am;1258cm上移到1252Cnl_.,而且BR与BR相比,1186cm处的峰明显增强.近紫外区圆二色谱显示,两种突变体近紫外区的正负带虽然没有太大差别,但288

3、rim和290nm处的极峰却差别显着.所有这些研究结果表明,细菌视紫红质Asp38(D38)突变为Arg(R)可以延长其光循环后半程M态和N态的寿命.关键词:细菌视紫红质;重叠PCR;质子通道;光循环中图分类号;Q78文献标识码:A0引言细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,BR)是嗜盐菌细胞膜上一种具有光驱质子泵功能的蛋白质,它是自然界中除叶绿素系统之外的惟一光合系统_1.作为嗜盐菌紫膜(purplemembrane,PM)上惟一蛋白质,BR约占紫膜干重的75,由248个氨基酸分子折叠成AG7个跨膜螺旋,通常以三聚体形式存在,并形成二维的六角形晶格状结构.每一个BR分子都由一个视

4、蛋白分子和一个视黄醛分子构成,色素分子通过Shiff键与G螺旋Lys216的叫氨基相连-.BR受光激发后,全反式的视黄醛分子异构为13cis结构,并经过形成一系列热平衡中间态(BRK63oL5一M?N55o06+B7o),最终返回基态BR.此外,0中间态的视黄醛还可以异构为9-cis结构,进入分支光循环,经P和Q啪返回基态J.在所有中间态中,M态和P,Q态最有应用前景.但天然BR分子的M态寿命很短,而P,Q态虽然寿命较长,但量子效率较低,从而限制了它的商业开发4.目前对BR分子的改造主要通过3种方法:调节pH值,化学修饰和定点突变_5.长期以来,位于质子传递通道入口处的Asp38(D38)在后

5、半程光循环(MN一0一BR)中的作用,以及它在质子吸收和膜内侧(cytoplasmic,CP)半通道(即CPSchiff碱基,也叫内通道)中的地位,一直存在争议.傅立叶红外光谱(FTIR)试验显示,BR蚴与野生型BR的构象无明显差别,所以有人认为,D38在光循环中无关紧要.BR蛋白的同源比对结果也显示出D38一R(Arg)的突变似乎是无义的,因为至少存在6种BR样蛋白在这一位点的氨基酸就是ArgE.然而,Riesle等认为,BRD38R的质子泵效率降低,M态寿命明显延长,作为质子传递通道的第一个氨基酸,D38应该是质子吸收和质子传递内通道的关键氨基酸,并对后半程光循环产生重大影响.因此,本研究

6、在D96N的基础上,通过引进D38R突变,以期得到具有更长M态寿命的收稿日期:20060527十通讯联系人E基金项目;国家自然科学基金资助项目(60677038)作者简介;王友亮(1974),男,硕士生.现从事微生物学分子生物学研究.武汉大学(理学版)第52卷BR突变体,同时通过光谱学分析,研究D38R所引起的BR结构的改变,从而了解D38在质子传递内通道中的地位以及对后半程光循环的影响.1材料和方法1.1实验材料盐沼盐杆菌(H.salinarium)L33由Keszthlyi教授(HungarianAcadamyofSciences)惠赠,盐沼盐杆菌(

7、H.salinarium)S9和大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5由本实验室保存,克隆载体pUC18由本实验室保存,大肠杆菌和嗜盐菌的穿梭表达载体pXLNovR由Needleman(WayneStateUniv.USA)教授惠赠.复合培养基(CM),嗜盐菌再生固体培养基,半固体培养基,原生质形成液,原生质稀释液均参照Clines等的方法.限制性内切酶BamHI,HindIII购于大连宝生物,DNA连接酶购于华美公司,PfuDNA聚合酶(高保真)购于TaKaRa公司,DNA回收试剂盒购于三博远志,其他生化试剂均为分析纯.1.2PCR引物设计根据Genbank中Ha&bact

8、erium的bop序列,用软件PrimerPremier5.0设计3对引物,其目的是对BR蛋白进行D96N单突变和D96N/D38R双突变.引物由北京三博远志公司合成.3对引物序列如下:bop上游引物P1(含BamHI位点):5,-CCGGGGATCC(ACGTGAAGATGGGGCFC3bop下游引物P2(含HindIII位点终止密码):5一CAGTGCCAAGCTTCTAGAATCA(TCG一3D38R突变引物P3(含D38R突变位点):5GTCTCGGACCCACGTGCAAAGAAATTC一3D38R互补引物P4(P3的互补序列):5GAATTTCTTTGCACGTGGGTCC(AGA

9、C一3D96N突变引物P5(含D96N突变位点):5LCGAGCAACGCGAGGTTTAACAACAAC一3D96N互补引物P6(P5的互补序列):5GTTGTTGTTAAACCTCGCGTTGCTCG一31.3BR胂单突变bop基因的重组克隆和表达载体的构建H.salinariumS9的培养和全基因组的提取参照文献1O的方法.以S9全基因组为模板,分别用引物Pl和P6扩增出小片段S4,用引物P2和P5扩增出小片段S3.反应条件:95.C预变性5min后先94C1min,373Os,72.C1min5个循环,再941min,5830S,72C1min20个循环,72保温1Omin;以S3,s

10、4作模板,P1和P2为引物扩增出全长的D96N突变基因bop反应条件:95预变性5min,94.C45S,56.C45s,721.5min,30个循环后72保温10min.将克隆的D96N突变基因bopGA与pUC18用BarnHI,HindIII双酶切,连接后转化E.coliDH5a并用60mg/I含氨苄青霉素的IB平板筛选阳性转化子,进一步用PCR和双酶切鉴定,所获得重组克隆载体命名为pUCbopG.,送三博远志公司测序.再将测序正确的bop基因亚克隆入穿梭表达载体pXI一NovR,转化大肠杆菌DH5a并用含50mg/L四环素的IB平板筛选阳性菌落,PCR和双酶切鉴定阳性转化子,重组表达载

11、体命名为pXL-bop1.4BR./双突变体bop基因的重组克隆和表达载体的构建以pUCbop.32.为模板,分别用引物P1和P4扩增小片段S2,用引物P2和P3扩增小片段S1,反应条件:955min,941min,5830s,721min28个循环,72.C保温10min;再以S1和S2作模板,P1和P2为引物扩增得到全长的D38R/D96N双突变基因bop.2325A,反应条件同1.3节.同样方法构建重组克隆载体pUCbop川.幽,送三博远志公司测序后亚克隆重组表达载体pXLbopllA】52(21.5嗜盐菌同源转化和筛选参考Cline等的方法J,提取质粒pXLbopGA,pXLbopG2

12、(25A,同源转化盐沼盐杆菌I33后,用含0+3mg/L新生霉素的再生固体培养基筛选阳性转化子.同时用空载体作阳性对照,去离子水作阴性对照.提取阳性转化子质粒用BamHJ和HindIII双酶切检测.1.6BR蛋白的提取及聚乙烯PVA-BR膜的制备挑取盐沼盐杆菌I33转化子的紫色单菌落,于5mI含有0+3mg/I新生霉素的CM培养基中,37.C光照培养至对数期,再扩大培养后离心收集菌体,加入300mI去离子水和10mg/LDNA酶,10.C轻摇过夜,用截流最为20000的透析袋于0.15mol/INaC1中4.C透析24h.参照徐冰等的方法提取BR蛋白,冻干保存.细菌视紫红质聚乙烯复合膜(PVA

13、BR)的制备参考Lensu等的方法【.1.7光致变色和M态寿命测量PVABRm6N和PVABRI).8R册6N样品用650nm激发光激发,使PVABR膜光致变色,用显微照像第6期王友亮等:D38R突变对细菌视紫红质光循环后半程M态和N态的影响747技术记录其光致变色现象.并通过显微视频测量其M态的寿命.1.8圆二色谱(cD)的样品制备和测定用Tris缓冲液和乙二醇(1:2)配制样品浓度约为2g/L的混合液(pH8.0).混合液于一20.C冰箱过夜,进行暗适应处理后,用10Uw钨灯通过绿色滤光片(约530nm),距离15cm照射20rain,使样品转变为光适应状态.用圆二色谱仪(El本Jasco

14、J810)在室温下以50nm/min速度,扫描240440nm近紫外区圆二色谱,狭缝设定2nm,取点间隔0.1nm.1.9PVA-BR复合膜的制备及拉曼光谱测定PVABR膜的暗适应一光适应转变方法同上.样品用激光共聚焦显微拉曼仪(英国.RM1000)进行光谱测定.Ar作激光器,以2.4mw的能量,波长为514.5nm的激发光,按10S间隔激发样品,狭缝设定50/,m.2结果2.1bop基因的定点突变根据Genbank中Halobacterium的bop基因序列,我们设计的引物P1位于5端上游约400bp处(包含启动子非编码区),以及3端终止密码下游19bp.基因片段全长1205kb.用重叠PC

15、R方法扩增片段的琼脂糖凝胶电泳如图1所示:bop.基因小片段S1,S2,bopmI25A基因小片段S3,S4.全长基因片段bopG.25A和bop6.A的大小都与理论值(S172lbp.S2484bp,S3553bp,S4652bp,bop(25A与bopGl51【:A152【G325A一1205bp)卡日符.将全长的单突变和双突变bop基因克隆到pUC18载体,获得重组克隆子pUCbopo和bp20001000750500250bp20001000750500250图1PCR扩增突变bop基因片段1:DI2000maker;2:以s9为模板所扩bop【m5A小片段s33:以s9为模板所扩bo

16、p(5325A小片段S4;4:以bop【5A为模板所扩小片段S1;5:以bop26A为模板所扩小片段s2;6:以s3,s4为模板所扩单突变基因bopG325A7:以s1,S2为模板所扩双突变基因bopclslcA152G-G325A;8:DI2000makerPUCbOpGIlC.Al52(25A.重组克隆载体pUCbop和pUCbop(151cI52(A经BarnHI和Hind双酶切后,其琼脂糖凝胶电泳如图2所示,分别得到约为2.6kb(2泳道)和1.2kb(3泳道)的两条带.与pUC质粒和bop基因的大小相符核苷酸序列测定结果示,D96N单突变基因bopG=I:25A和D38R/D96N双

17、突变基因bop.l51cu.与所设计的定点突变位点一致._2000一l000750500_25O图2重组质粒的PCR和双酶切检测(B2T?IH和HindUI)1:AHindmaker;2:pUCbop【5双酶切;3;pUCbop.151CA152(G325A双酶切;4:pXIbop(aazsA双酶切;5;pXIbopc,151cA152(G325A双酶切;6:pUCbopc,3zsAPCR检测;7;pEC_bopG151c_Al52rr(25APCR检钡4;8:pXLbop;32SAPCR检钡4;9:pXLbopG151CAI52(;325APCR检测;10:DI2000maker2.2单突变

18、体和双突变体bop基因的重组表达载体的构建和同源转化如材料方法所述,筛选出大肠杆菌DH5a阳性转化子.并将重组克隆载体中的各种突变bop基因亚克隆至表达载体pXLNovR,构建的重组表达载体转化盐沼盐杆菌I33后.用含新生霉素的CM平板筛选.转化子菌落为紫色,阳性对照菌落为白色.阴性对照无菌落生长.提取盐沼盐杆茼I33阳性转化子的重组载体,分别用PCR和双酶切进行检测,结果如图2所示:重组表达载体pXLbop和pXI一bop1【l_Al52.GA经BarnHI和Hind双酶切后.得到约为13kb和1.2kb的两条带,与pXl质粒和bop基因大小相符;重组克隆载体pUCbopGA和pUCbop1

19、_15批啪25A,重组表达载体pXLbop删5A和pXLbop5lc(5A的PCR检测产物,也与bop基因大小相符.以上试验结果表明,成功地将细菌视紫红质单突变体BRD.和双突变体BR.姗加.的bop基因亚克隆到了穿梭载体pXI一NovR中,获得了重组表达载体pXIbop剐和pXI一bopGl5lc一I52G-C,325A.2.3BR嘲R/I和BR呻6N的SDSPAGE电泳检测提纯突变蛋白,SDSPAGE电泳检测结果如图3所示:BRR6N和BR大小均约为26000,与BR分子量一致,而对照组的盐沼盐杆菌I33细胞三Il77l27引弘弛96422748武汉大学(理学版)第52卷bp97400?-

20、?66200?r-一43000?.一3l0002OlOOl4400图3SDSPAGE电泳1:分子量标记2:野生型BR;3:L33细胞膜抽提物;4:纯化BRm6N蛋白;5:纯化BRDsOR/D96N蛋白膜抽提物中则没有BR蛋白.2.4BR突变体的光致变色现象和M态寿命用纯化的BR突变体蛋白制备聚乙烯复合膜PVABRD96N,PVABRD/D96N.用650nm激光激发PVA/BR薄膜样品,显微镜下观察BR分子的光致变色现象并通过显微视频记录M态延迟的时间.记录结果:BRD96NM态衰退的时间为3s,BR)38NM态衰退的时间延长到了5S,约是BR.的1.67倍.2.5拉曼光谱测定在PVABRDN

21、和PVABR)38R删6N膜的拉曼光谱中,1530am,1548cm代表l3一cis双烯键CC,是N态的典型特征,1006cm_.,1440cm和l620am也都是N态的特征峰,这说明两者都有N态的延迟(图4).另一N态特征峰1328cm在BRD38R/I)96中出现,而BRD.N中没有,它代表l3-cis视黄醛酰胺键CN-H的摆动模式.1186cm-1是野生型BR蛋白N态视黄醛分子CC单键拉伸模式的特征.对于BR来说,1186cm与BR相比也明显得到了增强,这是由于含13一cis视黄醛的N态样BR蛋白有更多积累的结果.此外,PVABRDcj6N和PVABRm96N的拉曼光谱中,1200cm,

22、1304cIn_.,1336cm都是M态的特证峰,说明两个样品巾也都有长寿命M态的存在.拉曼光谱可以检测到寿命超过22ms的光循环中间体.pH6.5时野生型BR的M态寿命为1ms,N态寿命为2ms,O态寿命为8ms,因此,室温下拉曼光谱检测不到这些中间态.然而,当引入D38R,D96N突变位点后,导致了BR分子M态和N态的延迟.而且,BR.加.的延迟比BR.更为明显.从图4可以看出,野生型的l170am在BRI中下移到1171cm,在BRD巾5)中下移到1173cm;1258CITI在BRD中上移到1255cm,在BRD川/I圳N中上移到1252cm一.研究表明,1170cm的拉曼上移和125

23、8am拉曼下移是蛋白质中氢键体系功能增强的结果u.因此,BR1)38中氢键网络的功能弱于BRN,而BRDN又比野生型的弱.800am是暗适应BR蛋白13一cis视黄醛酰胺键CN的构象特征,几个样品中都未发现该峰,说明它们均处于光适应状态.2.6圆二色近紫外区光谱测定通常,紫膜的近紫外区都有正负两条带,且在270290nm之间经常有极值出现,该极值的变化,可以显示出蛋白中芳香族氨基酸微环境的变化.因此,近紫外CD谱可作为一种灵敏的光谱探针,反映Trp(w),Tyr(Y)和Phe(F)以及二硫键所处微环境的扰动,用来研究蛋白质三级结构的精细变化ll1.如图5所示,BRL138R佃6N和BR腓N近紫

24、外CD谱的290rim极峰在288nm处都有一明显肩峰,几乎呈现双峰的特征,而野生型的肩峰则很不800(3)一15504.750l000125015001750波数/cm图4暗适应转变为光适庖的PVABR,PVABRn.和PVA-BR儿).样品的拉曼光谱PBV-BR膜由300L13.6g/LBR蛋白,750I5%PVA,3Llmol/I的磷酸缓冲液以及终浓度为5Ommol/L的HEPES制成的混合液,铺于30ram25ITlm的载波片上,室温下干燥.拉曼光谱的测定也在室温下进行:.叫.6勰43.n如:.1O加哲l1,加二=.如.;二=.第6期王友亮等:D38R突变对细菌视紫红质光循环后半程M态

25、和N态的影响749明显.且两个突变体的正负带也都比野生型显得舒缓一些.而双突变和单突变相比,除正负带稍为舒缓外,极峰更加突出一些外,区别并不明显.图5野生型BR,BRD6N和BRR的近紫外圆二色谱BR样品悬浮于Tris和乙二醇配制成的混合液中(pH8.0),浓度约2g/L,经光适应一暗适应后室温测量3讨论本研究发现BRD3R/I.比BR.具有更长的M态寿命,这说明D38R对M态的延迟是有贡献的.Riesle发现了BR.M态的延迟,但并没有发现N态的延迟l_8.本研究通过PVABR./Dg与PVABR瑚拉曼光谱的比较,发现将D38R引入BR瑚.突变体中,除延长了M态的寿命外,还对N态的延迟有很大

26、贡献.Asp96(D96)把质子传递给去质子化的Schiff碱基的过程中,BR转变为M态.这个过程需要通过由水分子参与形成的氢键网络来完成.BR/伪的拉曼光谱分析表明,与BR相比,它的氢键体系功能减弱,且均弱于野生型.由此可见,D38一R和D96-N(Asn)很可能是通过减弱了负责质子传递的氢键体系而使光循环后半程的中间态M和N延迟.BR【=)38R/Dg.,BR.和野生型BR的近紫外区CD谱表明,D38突变为R后虽未导致BR分子三级结构的明显变化,但是扰动了质子传递内通道中芳香族氨基残基的微环境,从而影响了质子的吸收和传递.在CP侧和内通道中存在的芳香族氨基酸:B螺旋的F42,Y43,E螺旋

27、的Y147,YI50,F156,F螺旋的F171和G螺旋的F219.其中已经报道过的一些芳香族氨基酸残基的作用和本文的结论一致,如F42在内通道的质子传递中起重要作用;FI71和F219通过与Asp96,Schiff碱基相互作用而影响质子的传递.等.我们推测,D38一R的突变并不对BR的三级结构产生影响,却通过影响通道中某些芳香族氨基酸残基而改变BR的精细三级结构,通过影响质子的吸收和在内通道中的传递而使光循环后半程的中间态M和N寿命增长.长期以来,对质子释放通道即质子传递外通道的研究已经取得很大进展,尤其对影响分支光循环中间态P态,Q态相关氨基酸的研究,为BR分子的实际应用展示了美好的前景.

28、但目前对质子吸收和传递内通道相关氨基酸的研究却很少,希望本文的工作可以为BR的应用研究另外开辟一条道路.参考文献:1冯晓强,杨文正,白永林,等.细菌视紫红质近场光存储特性的研究_J.应用光学,2004,25(6):58.FengXiaoqiang,YangWenzheng,BaiYonglin,eta1.StudyontheNear-FieldOpticalStoragePropertyofBacteriorhodopsinJ.JAppliedOptics,2004+25(6):58(Ch).2陈德亮,胡坤生.细菌嗜紫红质研究的新进展J.生物物理,2001,17(3):441448.ChenD

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