《疫学应用》课件.ppt

1、第十五章 免疫学应用,教学目的： 掌握：基于抗原抗体反应的检测方法；免疫细胞的检测方法 ；人工（自然）主动免疫、人工（自然）被动免疫的概念。 理解：基于抗原-抗体反应的特点及影响因素；免疫分子的检测原理；免疫细胞的检测方法与原理；以抗体、细胞和细胞因子为基础的免疫治疗 了解：免疫分子的检测原理；免疫学诊断的原理、常用的免疫功能检测指标；免疫治疗制剂的类型和作用机制,教学重点： 基于抗原抗体反应的检测方法及原理；人工（自然）主动免疫、人工（自然）被动免疫的概念。 教学难点： 抗原-抗体反应的特点及影响因素,使用教材： 医学免疫学（第二版），龚非力主编，科学出版社，2007年。 参考教材： 医学免

2、疫学（第五版），金伯泉主编， 人民卫生出版社，2008年；,主要内容,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法 第二节免疫细胞的检测 第三节免疫分子的检测 第四节 免疫学预防,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法,抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction) 应用： 用已知抗原检测未知抗体； 用已知抗体检测未知抗原： 定性或定量检测体内各种分子； 用已知抗体检测半抗原物质,一）特异性和交叉反应 特异性：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。 分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间

3、构型的互补性,一、抗原-抗体反应的特点,交叉反应（cross reaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应,结合价： 天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为两价。 前带现象（prozone）和后带现象(postzone) Ab过剩和Ag过剩,二）抗原-抗体结合的带现象与可见性,前带现象（prozone）和后带现象(postzone) Ab过剩和Ag过剩,比例合适： 若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原决

4、定基结合，相互交叉连接成网格状复合体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要,抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pH、高浓度盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体,三）可逆性,一）电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体,二、抗原-抗体反应的影

5、响因素,二）酸碱度 抗原抗体反应的最适pH是6-8。 （三）温度 最适温度为37。有些例外，如冷凝集素在 4左右与红细胞结合最好，20以上反而解离,四）抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。 此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应,抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力,亲和力(affinity,一个抗体分子与整个抗原分子间的结合强度,亲合力(avidity,根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类： （一）凝集反应 （二）沉淀反应 （三）补体参加的反应 （四）免疫标记技术,三、Ag-Ab反应的基本检测

6、方法,颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应(agglutination),一）凝集反应（Agglutination Tests,1直接凝集（direct agglutination) ： 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。 2间接凝集（indirect or passive agglutination) ：检测针对可溶性Ag的Ab 3间接凝集抑制试验 (direct agglutination inhibition test) 4. 协同凝集试验（co-agglutination test,1直接凝集,Applic

7、ations Blood typing（血型测定） Bacterial infections（细菌性感染,Practical considerations Easy（简便） Semi-quantitative（半定量,2、间接凝集,Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particle,Applications Measurement of antibodies to soluble antigens,3、间接凝集抑制试验,应用：可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其 灵敏度高于一般

8、间接凝集试验,各种凝集反应示意图,Ag-Ab反应的基本检测方法 （一）凝集反应 （二）沉淀反应 （三）补体参加的反应 （四）免疫标记技术,Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。 该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀,二）沉淀反应（Precipitation Tests,1单向免疫扩散(single immunodiffusion) 2双向免疫扩散(double immunodiffusion) 3免疫电泳(i

9、mmunoelectrophoresis) 4免疫比浊(immunonephelometry,二）沉淀反应,单向免疫扩散(single immunodiffusion,双向免疫扩散(double immunodiffusion,单扩与双扩原理,Ag-Ab反应的基本检测方法 （一）凝集反应 （二）沉淀反应 （三）补体参加的反应 （四）免疫标记技术,用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点,四）免疫标记技术 （Immunola

10、belling technique,此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位,1免疫荧光法 (immunofluorescence,IF,1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。 （2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强,免疫荧光法分类,免疫荧光法图示,Mouse kidney section,Laminin

11、 - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342,Control,TSLP,TSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide,HASMC,此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。 常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP,酶免疫

12、测定 (enzyme immunoassay, EIA,常用的方法如下： （1）酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) （2）免疫细胞或组织化学（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC,1） ELISA 是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。 优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等,双抗体夹心法： 用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针

13、对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。 间接法： 用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应,ELISA分类,间接法图示,ELISA反应过程,动画演示,2)酶联免疫斑点试验(ELISPOT,生物素（biotin）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。 亲和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由4个亚单位组成。 生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性,3）BAS（biotin avidin system)-ELISA,BAS-EL

14、ISA,应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位,4）免疫细胞或免疫组化技术,ICC,IHC,乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。 该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等,3放射免疫测定法 (radioimmunoassay, RIA,化学发光免疫分析,将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发

15、下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。 该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素,该法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。 该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原,免疫印迹法(immunoblotting,免疫印迹法,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法 第二节免疫细胞的检测 第三节免疫分子的检测 第四节 免疫学预防,一、 淋巴细胞及亚群的分离,外周血单个核细胞(PBMC)的分离：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴

16、细胞分离液）密度梯度离心法,淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及 功能差异而分为不同的群和亚群。 1尼龙棉分离法 2E花环分离法 3洗淘法 4流式细胞术(flow cytometry，FCM) 5磁珠分离技术,E花环实验,磁珠分选,Removal of T cells from marrow graft,二、免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定： (1) 细胞增殖(转化)试验： 可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。 * 丝裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等,淋巴细胞增殖实验,2) T细胞介导的细胞毒试验：C

17、TL,1) B细胞增殖(转化)试验 (2) 溶血空斑形成试验 (3) 酶联免疫斑点法(ELISPOT,2. B细胞功能判定,溶血空斑实验,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法 第二节免疫细胞的检测 第三节免疫分子的检测 第四节 免疫学预防,在体外用已知抗原检测相应抗体：见前述 用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定： 检测血清含量高的IgG、IgA和IgM时，可用免疫比浊法； 检测IgD和IgE选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法。 诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法,一、免疫球蛋白的测定,了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高

18、的C3、C4、B因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法。血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果,二、补体测定,一）免疫学测定法 以细胞因子作为抗原，用相应抗体进行定量或半定量检测。对于分泌性细胞因子，常用方法为双抗体夹心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印迹法等方法检测。对于胞内细胞因子，采用FCM免疫荧光技术检测,三、细胞因子（CKs）检测,二）生物活性测定法 根据细胞因子特定的生物学

19、活性，借助相应指示系统，如选用各种依赖性细胞株或靶细胞，同时与标准品对照测定，从而得知样品中细胞因子活性水平，一般以活性单位（U/ml）表示。 （三）分子生物学测定法 具体方法为聚合酶链反应（PCR）、实时定量PCR等,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法 第二节免疫细胞的检测 第三节免疫分子的检测 第四节 免疫学预防,一、免疫学预防,免疫学预防（immunoprophylaxis）是指通过人工刺激机体产生或直接输入免疫活性物质，从而特异性清除致病因子，达到预防疾病的目的,免疫包括： 先天免疫：生物体在长期种系发育和进化中逐渐形成的一系列防卫机制。 特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原刺激后主动

20、产生或被动获得的,特异性免疫获得方式有两种： 1、自然免疫（natural immunization,自然主动免疫：指机体受到各种病原体隐性或显性感染后主动产生的特异性免疫。 自然被动免疫：指机体经胎盘或初乳被动获得的特异性免疫,2、人工免疫（artificial immunization） 即免疫学预防，指采用人工方法，将疫苗、类毒素或含特异性抗体和细胞的免疫制剂接种于人体，以增强宿主的抗病能力。 人工主动免疫 人工被动免疫,人工主动免疫(artificial active immunization)： 指给机体接种抗原性物质如疫苗、类毒素等，刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。 人工被

21、动免疫(artificial passive immunization)： 指给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞 因子等制剂,使受者迅速获得特异性免疫力的方法,人工自动免疫与人工被动免疫的比较,人工主动免疫的接种物,疫苗（Vaccine）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。 理想疫苗的标准：安全；有效；实用,分类： 1、死疫苗（death vaccine）:选用免疫原性强的微生物标准株经大量培养后，用物理或化学方法将其杀死或灭活而制成的预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。 优点：主要诱导特异性抗体产生，安全 缺点：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反应严重,2、减毒活疫苗（live-attenuated Vaccine） 用人工