临床血液学：血液病MICM检验

1、血液病MICM检验,背景介绍,血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。,出血性疾病,贫血症,白细胞疾病,常见血液病,造血系统恶性肿瘤,FAB分型 1976,MIC分型 1986,MICM分型 2001,MICM分型 2008,白血病的诊断分型：MICM分型发展由来,MICM分 型 2016,1827年， 法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病 1847 年，Virchow首次提出了“白血病”这个名称 1976年，法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态为主，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白血病诊断与分型的开

2、端 80年代末至90年代初，随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型 WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案（2001， 2008、2016）,FAB分型及WHO分类,FAB：主要建立在形态学基础上 WHO (2001和2008、2016) 骨髓或外周血原始细胞比例20% 将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志 将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量,FAB和WHO分类方案的主要区别,急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 WHO分型,伴再现性遗传学异常的AML 伴MDS相关改变的AML

3、继发于MDS或MDS/MPN 伴有MDS相关细胞遗传学异常 2或3系50%以上的细胞有发育异常 治疗相关性AML 不另作分类的AML 髓细胞肉瘤 Downs综合征相关髓系增生疾病 母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤,伴再现性遗传学异常的AML,AML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1T1 AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)CBFB-MYH11 APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RARA AML with t(9;11)(p22;q23)MLLT3-MLL AML with t(6;9)(p23;q34

4、)DEK-NUP214 AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)RPN1-EVI1 AML -M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1 ? AML with mutated NPM1 ? AML with mutated CEBPA,通常AML的诊断标准，原始细胞比例20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，AML诊断成立,MICM FAB形态学诊断(Morphology) 免疫学检查(Immunology ) 细胞遗传学检查(Cytogenetics) 分子遗传学检查(Molecul

5、ar),MICM分型原则中各检测技术简介,形态学：外周血涂片、骨髓涂片骨髓活检 免疫表型检测：多参数流式细胞仪 细胞遗传学检测 常规核型分析，分子核型分析 FISH 分子遗传学检测 融合基因检测（RT-PCR）：PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-、BCR-ABL 基因突变：FLT3-ITD、CEBPA、NPM1、TET2、IDH1、NOTCH1、IKZF1、FBXW7 拷贝数变化（CNV）:SNP-array 高通量测序技术,病史 形态学： 结构：活检 细胞学：涂片 骨髓血凝块 免疫分型： 流式细胞或免疫组化 细胞遗传学：核型分析、FISH 分子遗传学：融合基因

6、（RT-PCRQ-PCR)/基因突变（测序）,白血病MICM诊断程序及技术,白血病诊断的任务不仅仅是FAB分类,是不是白血病？ 急性？慢性？ 系来源 FAB分类 预后分层 治疗、疗效判断 MRD,病史+形态,形态+免疫,形态+免疫+遗传+分子,形态+免疫+遗传+分子,为什么需要MICM综合诊断？,形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%； 在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上； 染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率,MICM整合诊断的临床意义,全面正确诊断与分型 评估预后 确立检测MRD的标志，追踪MR

7、D 帮助建立分层、个性化的治疗 定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变 帮助确定病因或发病机制,MICM分型原则中各检测技术简介,细胞形态及细胞化学分析的优缺点,优点： 直观：镜下直接观察细胞形态，对MDS的诊断、一些少见的、大的恶性细胞的确定优于流式细胞分析恶性细胞的比例更准确： 简单快速，有显微镜即可完成报告 缺点： 人为因素影响大 难以鉴别细胞的成熟阶段，B、T等系列的恶性细胞 细胞较成熟时，难以鉴别良恶性 不能提供太多的预后信息,形态M,病理及免疫组织化学的优缺点,标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、MM、淋巴瘤、转移癌

8、、组织细胞、巨噬细胞、树突细胞、何杰金细胞等 可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位 诊断慢、受诊断者个人经验及知识水平影响大 对一些组织结构无破坏、细胞形态改变不大的细胞，难以鉴定良恶性及成熟度 有些恶性细胞在液体中，难以获取组织标本，难以判断组织结构,形态M,流式细胞术,流式I,FCM检测的参数,FSC:细胞大小 SSC:细胞内颗粒多少及细胞内构造的复杂性 FL：3-10多种（荧光素耦联的单克隆抗体）,流式I,R8：幼稚细胞群，正常骨髓中此群细胞数量极低或空缺,流式I,确定系来源 原理：不同系有特定的抗原表达 髓系/B系/T/NK系/组织细胞和树突状细胞 确定细胞分化阶段 不同

9、发育阶段细胞，其抗原表达不同 预后判断 有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关 治疗方法选择-治疗靶向 疗效判断、复发监测 诊断双表型、混合性，M0、未分化型等特殊类型白血病 髓系分亚型与FAB分亚型有一定差异,1）血液系统肿瘤的免疫表型分析,流式细胞免疫分型的作用,I： immunology,免疫学,M0 CD34,CD33,CD13 M1 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR M2 MPO,CD34,CD15,CD13, HLA-DR M3 MPO, CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常阴性) M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 M5 CD

10、68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，CD64 M6 CD33,CD235a,CD71 M7 CD33,CD41,CD42b,CD61,急性髓系白血病免疫表型与FAB分型相关性,形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。FAB基于形态，两者不符以形态为主。,流式I,混合性白血病的判定,如有2 系或以上的特异性标志，可诊断为急性混合性白血病,流式I,MRD流式细胞学检测,肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同 跨系表达 抗原表达不同步 抗原表达丢失 抗原表达减弱 其它抗原表达 初始免疫分型结果、白血病相关表型特点 抗体组合越多覆盖率

11、越高、敏感性越高 假阳性、假阴性均存在 随访、动态观察更有意义,流式I,监测外周血造血干细胞的动员效果 指导外周血造血干细胞的采集时机 判断造血干细胞采集量 3）红细胞分析 网织红细胞计数 血细胞CD55和CD59表达水平分析 红细胞内HbF的分析 红细胞表面相关免疫球蛋白测定,2）造血干/祖细胞计数（CD34+细胞的测量）,流式细胞免疫分型的作用,流式细胞免疫分型的作用,4）血小板分析 循环血小板活化分析 血小板对体外不同刺激剂的反应性测定 血小板免疫表型分析 血小板自身抗体测定 血小板免疫计数 网织血小板计数 抗血小板药物治疗监测 5）外周血淋巴细胞亚群计数 监测肿瘤患者的病情 监测机体的

12、免疫状态 监测病毒感染等等,FCM的优缺点,优点： 一次可检测数万至数十万个细胞上的数十种标记，可同时检测每个细胞的六个以上参数，敏感性高，分析全面 更容易区分良恶性，恶性细胞的系列及成熟度 可帮助确定免疫治疗的靶点并监测疗效，如CD20、CD19是监测MRD覆盖面最广的方法。 快速、简便、重复性好 缺点： 不能确定组织结构，一些罕见的大细胞不能分析到，一些细胞粘附性高，难以抽出。因此对HL等难以确诊。 判断恶性细胞的比例不如形态准确，对M6、MDS的诊断不如形态 预后价值不如染色体和基因的检测,流式I,诊断误区举例,原始细胞增多是诊断前体恶性血液病尤其AL的重要指 标，但原始细胞应根据免疫学

13、标志/基因/染色体证实 为恶性造血前体细胞 一些形态上的原始细胞可以是正常造血细胞（尤其见于儿童感染后，G-CSF,GM-CSF等刺激或化疗后或移植后）,病例1 儿童B-ALL,化疗3年后停药，来我院复查，骨髓涂片8%的幼稚细胞,流式幼稚B淋巴细胞增生，未见异常表型,病例2 NK细胞白血病移植后40天，骨髓涂片8%的幼稚细胞,流式: 未见表型异常细胞，CD34阳性细胞为幼稚B淋巴细胞,即染色体异常 包括染色体的结构和数量异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类、预后分层及指导治疗。,细胞遗传学C,血液染色体检验,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010

14、,确定染色体数目=46,发现Ph； 发现+21,各种显带技术出现；发现多数AL患者伴有染色体异常,FISH出现；阐明某些染色体异常的分子学改变,SKY CGH PCR技术 FLT3-ITD(1996) c-KIT突变（1993） .,芯片技术：cDNA array、SNP-array、 测序技术的发展 大量基因突变的发现：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.,新一代高通量测序技术；各种遗传学改变间的相互作用,白血病遗传学研究的历史,细胞遗传学C,细胞遗传学C,多数AML患者有非随机性染色体改变，包括易位、倒位、插入、缺失、扩增

15、、等臂染色体等 染色体异常在AML诊断、分型、预后评价、发病机制研究及靶向治疗药物研发方面有重要价值 一些特殊的细胞遗传学异常在WHO分型建议中已被列为特殊亚型 对不同细胞遗传学类型的血液肿瘤患者进行个体化治疗可以获得更好的疗效,AML的WHO分型,伴再现性遗传学异常的AML 伴多系发育异常的AML 继发于MDS；无MDS病史,治疗相关性AML,烷化剂相关；拓扑异构酶抑制剂相关；其它,无法分类的AML 髓细胞肉瘤,Downs综合征相关AML,细胞遗传学C,伴再现性遗传学异常的AML,AML with t(8;21)(q22;q22) AML with inv(16)(p13.1q22) or

16、t(16;16) APL with t(15;17)(q22;q12) AML with t(9;11)(p22;q23) AML with t(6;9)(p23;q34) AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) AML -M7 with t(1;22)(p13;q13),RUNX1-RUNX1T1 CBFB-MYH11 PML-RARA MLLT3-MLL DEK-NUP214 RPN1-EVI1 RBM15-MKL1,? AML with mutated NPM1 ? AML with mutated CEBPA 通常AML的诊断标准，原始细胞比例为20%，

17、但如果t(8;21)、t(15;17) 或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，白血病诊断成立,细胞遗传学C,细胞遗传学C染色体核型分析 正常核型： 男：46，XY 女：46，XX 异常核型： 46，XY，t(8;21)(q22;q22) 46，XX，t(15;17)(q22;q21.1) 47,XY,del(6)(q15),+11,-15,add(17)(p13),+mar16 ,MICM分型原则中各检测技术简介,Chromosome Banding technology,Conception,G带 R带,Structure and Nomenclature of chromosom

18、e,Structure,Nomenclature,Group and Karyotype for normal Chromosome,Abnormal Chromosome and diseases,约55%的AML患者可检出克隆性染色体异常 分子遗传学技术的进展使得多数AML患者检出基因水平的异常，如FLT3、CEBP及NPM1基因的突变 遗传学异常对于理解AML发病机制、建立新的诊断方法、研发治疗药物或指导临床治疗有重要的价值 在WHO分型建议中，一些特殊的遗传学异常被列为诊断和分型的依据 AML：50%90%的患者细胞遗传学可检出异常克隆 ALL：大约60%85%的患者可检出克隆性染色体

19、畸变,细胞遗传学C,Abnormal number,Abnormal structure,Abnormal structure of Karyotype： Congenital and Acquired,Description of Abnormal Karyotype,the mode of recording Chromosome 1p33.11 1号染色体短臂3区3带1 亚带1,Description of Karyotype 46,XX,t(8;21)(q22;q22) 20,AML常见染色体异常,单一异常：45% 2种异常：55%,-5/5q-；-7/7q-；8； -Y；+11；+1

20、3；+21; +22,3q26； del(9q) t(6;9)； t(9;22)等,t(8;21)(q22;q22),见于约10%AML，形成8号染色体上的AML1-ETO 融合基因 CR率高，EFS长，预后相对较好 20%-30%伴KIT突变，复发率增高，预后较差 75%伴性染色体丢失及del(9q)等附加异常，伴性染色体丢失不影响预后，伴del(9q)提示预后不良,AML-M2 t(8;21)(q22;q22),9q-,-Y,t(8;21)(q22;q22)模式图,Common abnormity of AML chromosome,AML-M3 +8, t(15;17),AML-M3 t

21、(11;17),ATRA敏感 ATRA耐药 ATRA相对耐药 对ATRA敏感性未定,CML t(9;22)(q34;q11),inv(16)(p13;q22)/t(16;16)(p13;q22),见于约5%AML、20%AML-M4及100%AML-M4Eo 遗传学特点： 因16号染色体较小及带型的限制，常规核型分析容易漏诊 有典型形态学改变及常见继发性异常的患者须行FISH或PCR检测CBF/MYH11融合基因 常伴继发性异常：+8，+21，+22 约30%患者亦存在KIT突变，复发率增高、预后欠佳 化疗敏感，预后相对好，易发生CNSL,AML-M4Eo 骨髓象,AML-M4Eo +8,in

22、v(16),FISH检测inv(16),inv(16)模式图,一些染色体有诊断价值: 如重现性染色体异常，如t(8;21)，inv(16)、t（16；16）、 t(15;17)（q22;q12），t(5;14)(q31;q32) ，t(3;3),t(4;11)可直接诊断急性白血病； 一些染色体和/或基因有辅助诊断价值，如5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY、P53 高度疑似MDS等； 有-7、5q-、 t(3;3)、t(4;11)、t(9;22)、复杂染色体等的急性白血病预后不好,染色体的诊断价值,细胞遗传学C,有丝分裂相少或缺如 染色体质量低劣，显带不佳 染色体异常复杂

23、如果恶性细胞不分裂，其结果是假阴性 由于分析的细胞少，有部分白血病患者无染色体异 常，监测残留白血病不敏感,白血病染色体分析存在的问题：,细胞遗传学C,荧光原位杂交（FISH）,利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记后与靶DNA进行杂交，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析,细胞遗传学C,荧光原位杂交 (FISH),生命科学中的“钓鱼” 技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 目的：获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息,荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）,细胞

24、遗传学C,细胞遗传学C荧光原位杂交（FISH） 探针类型 双色单融合（Dual Color, Single Fusion） 双色双融合（Dual Color, Dual Fusion） 双色分离（Dual Color, Break Apart） 额外信号（Extra Signal） 建议与染色体核型分析同时送检,细胞遗传学C,双色单融合示意图,细胞遗传学C,细胞遗传学C,细胞遗传学C,BCR/ABL双色双融合探针,细胞遗传学C,BCR/ABL额外信号探针,Role of Sex Chromosome in ALLO-BMT (异基因骨髓移植),细胞遗传学C,有独立的诊断及预后价值 可以检测出显

25、微镜下人眼难以分辨的染色体异常 诊断时间比染色体短 与染色体分析比较，对诊断人员的经验依赖程度低 对不分裂的细胞也可以分析，分析的细胞数量比染色体多，更能反映正常和恶性细胞的比例，监测残留白血病比染色体敏感 可以对既往的骨髓片回顾分析，进一步明确或排除诊断 探针昂贵，每次只能分析1-2种异常，只能分析已知的染色体或基因异常,FISH的优缺点,细胞遗传学C,FISH检测可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，FISH可能为阳性。,细胞遗传学C,1）染色体是独立的预后指标并有助与治疗方案的选择,细胞遗传学C,2）鉴别白血病微小残留病灶(MRL),白血病化疗或骨髓移植后达到完全缓解 体内残存微量白血病

26、细胞106-108 检测到原已消失的克隆性染色体异常和(或)新的克隆性染色体异常时，往往预示疾病将复发,3) 在骨髓增生异常综合征(MDS)中的应用,4) 在淋巴瘤中的应用,5）在其他血液病中的应用 真性红细胞增多症（PV）常见的染色体异常有del(2v)(q11)，+8和+9，可见于PV病程的始末。 原发性骨髓纤维化常见的染色体异常为-7，-9，+8，+2或lq、13q等结构异常。 在多发性骨髓瘤（MM)中的应用,The role of chromosome in Disease Monitoring,2Ph，+8，i（17q）,Abnormal chromosome recurrence,

27、CML in blastic phase:,6）新的异常染色体的出现常提示复发,有独立的诊断及预后价值 可以检测出染色体或FISH不能检测出的异常，联合染色体和 FISH，增加了对疾病预后的判断能力。 诊断时间比染色体及FISH短 与染色体及FISH分析比较，对检测人员的经验依赖程度低 是最敏感的监测残留白血病的指标 对试验设计、试验质控要求高 对无基因异常的疾病难以诊断 疾病是复杂的，仅有基因异常未必完全决定预后,基因检测的优缺点,分子生物学M,Dohner, H. et al. Blood 2010;115:453-474,在AML 中, 基因突变与细胞遗传学异常一样普遍,AML基因突变,

28、分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M融合基因 BCR/ABL：t(9;22)(q34;q11) PML/RAR：t(15;17)(q22;q21) AML1/ETO：t(8;21)(q22;q22) TEL/AML1：t(12;21)(p13;q22) E2A/PBX1：t(1;19)(q23;p13) ,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,血液病分子诊断的意义,分子生物学M,31种白血病融合基因 (122种变异体) 筛查,分子生物学M,分子生物学M,分子生物

29、学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,急髓相关突变检测,CEBPA基因位于19q13.11，CCAAT盒/增强子结合蛋白，粒细胞分化过程中起重要作用，预后良好 c-KIT基因位于4q11-21，t(8;21)和inv(16)伴c-KIT突变在AML预后危险分级中由“低危”升级为“中危” N-Ras为Ras基因家族成员之一，见于10%左右的M4、M5、M6，该突变预后意义尚不明 FLT3-TKD，Fms样酪氨酸激酶3-T

30、K区域点突变，13q12，预后不良,分子生物学M,AML患者常见基因突变和异常表达的预后意义,分子生物学M,骨髓增殖性肿瘤,分子生物学M,骨髓增生异常综合征,NCCN提及的MDS分子检测项目 TET2突变，见于20%MDS，预后较好 ASXL1突变，见于15%MDS，预后较差 RUNX1突变、EZH2突变、ETV6突变，预后较差 CBL突变、IDH2突变、U2AF1/U2AF35突变、SF3B1突变 SRSF2突变、ZRSR2突变，预后较差，增加白血病转化率,分子生物学M,分子生物学M,分子生物学M,MRD主要检测方法比较,血液肿瘤初诊检测方案建议,MICM整合报告,AL系别不清 形态学 流式

31、细胞术免疫分型 骨髓染色体核型分析 分子生物学白血病31种常见融合基因通筛,血液肿瘤初诊检测方案建议-AL,25个以上抗原，包括粒系、单核系、T系、B系、非系列特异性、干细胞（原始细胞）相关以及其他细胞等各种标志；除可以进行系别鉴定、亚型判断外，还可进行一定的预后评估。,可以宏观、全面地检查细胞内所有染色体的各种异常，但对于一些微小异常或隐匿性易位以及低含量的异常难以查出。 此外，由于标本本身等各种原因的影响，会有一定比例的无分裂相出现。 建议必要时配合行FISH检测。,诊断相关类： AML1/ETO：多见于M2，少见于M4和M1；M2b中最多 RAR相关融合基因：M3 PML/RAR PLZF/RAR NPM/RAR CBF/MYH11：M4Eo,用药相关类： BCR/ABL：格列卫 PML/RAR：全反式维甲酸（ATRA） NPM/RAR：全反式维甲酸（ATRA） AML1/ETO：大剂量的阿糖胞苷 CBF/MYH11：大剂量的阿糖胞苷,ALLT、B等不清 骨髓形态学 流式细胞术免疫分型 细胞遗传学检测 基因诊断急淋15种常见融合基因筛查或者融合基因BCR/ABL、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL/AF4定量检测,血液肿瘤初诊检测方案建议-ALL,流式细胞术免疫分型： T系：CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、