生物技术制药：硫酸软骨素裂解酶的研究进展

1、硫酸软骨素裂解酶的研究进展,Chondroitin sulfate,图1 硫酸软骨素基本单元,糖胺多糖作为蛋白聚糖的组成成分，主要分布在细胞外基质和细胞表面，用来指导很多生物过程，如细胞增殖、信号传输和炎症介导等。,硫酸软骨素 (Chondroitin sulfate，CS) 是糖胺多糖的一种，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脱氧硫酸-D-半乳糖通过-1,3 糖苷键相结合的双糖为基本单位，聚合而成的一类大分子多糖，双糖单位数目一般在5070 个，分子量约在550 kDa 之间 (图1)。,CS是一种酸性黏多糖类生物大分子，具有较强的降血脂作用和缓冲抗凝血作用， 临床上主要用于防治冠心病和

2、动脉粥样硬化。最新的研究发现， 当将硫酸软骨素的分子量降低至2 10 kDa时， 其药效更为明显，对防治动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效。另外，低分子量CS也可作为载体与某些药物结合以增强这些药物的药效。,Chondroitin sulfate,硫酸软骨素裂解酶 (Chondroitinase，ChSase) 是一类能将CS、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖及寡糖的裂解 酶。最早在细菌的抽提物中发现其对CS的降解作用，迄今为止已发现微生物可产生4种具有不同降解功能的ChSase。,ChSase 根据其作用底物的不同分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSas

3、e B 及ChSase C 等类型,Chondroitin sulfate,溶解椎间盘内髓核或破裂的纤维环 降解囊性纤维变性部位的黏液物 阻止玻璃体与视网膜的粘连 促进神经轴的再生 抗肿瘤作用 增强软骨细胞与软骨的黏附力,Chondroitin sulfate,1.发酵生产,2.ChSase的重组表达,第一步：硫酸软骨素酶粗酶粉的制备,第二步：硫酸软骨素酶的纯化,A.菌株的发酵培养,B.硫酸软骨素酶粗品的制备,A. DEAE-Sepharose 阴离子交换层析,B. Sephadex G-100 凝胶过滤层析,Chondroitin sulfate,ChSase的重组表达,ChSase AC

4、和ChSase B,对肝素黄杆菌中的ChSase AC 基因进行克隆，得到ChSase AC 的基因cslA，通过与麦芽糖结合蛋白 (Maltose-binding protein，MBP) 构建融合表达载体，在大肠杆菌中表达。,通过PCR技术由普通变形杆菌全基因组DNA中扩增硫酸软骨素酶ABC I的全长cDNA,在PGEM-Teasy载体中对其进行测序和扩增,后将其插入真核表达载体PcDNA3.1/V5/His,构建成真核分泌型蛋白表达载体pcDNA3.1/CABCI/V5/His。用该质粒转染人胶质瘤细胞系TJ905,并利用SDS一PAGE考马斯亮蓝染色和免疫印渍检测培养物上清中的分泌型融

5、合蛋白硫酸软骨素酶ABC I的表达情况,ChSase ABC,Chondroitin sulfate,（1）明胶海藻酸钠协同包埋法,（2）树脂吸附法,（3）磁性高分子微球法,（4）纤维素共价结合法,方法：采用明胶与海藻酸钠为载体,通过CaCI:硬化、戊二醛交联,对Chsase进行协同包埋固定化,方法：利用大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D380为载体,戊二醛为交联剂,进行固定化Chsase,方法：将PF凝胶（主要特点是它对底物(如多糖)有很好的吸附作用,而对产物(如低分子糖)没有亲和性,本身就可以用于多糖与低聚糖、单糖的分离）与磁性粒子结合,制备出磁性PF微球,再利用磁性PF微球固定化Chsa

6、se,方法：将一定量Chsase酶液在pH为磷酸缓冲液中与胺化纤维素载体共价结合。,Chondroitin sulfate,问题： 重组酶表达量不高，活性较低 分离纯化成本高,改进： 寻找新型菌株、表达策略及代谢途径实现酶的高效表达； 构建含有不同标签的融合表达载体实现酶快速和高效分离纯化； 研究新方法增强酶的热稳定性。,作为工具酶和药用酶, Chsase在科研及医药领域拥有广阔的发展前景。 制备低分子量的CS，糖胺聚糖的核心蛋白，抗蛋白聚糖的单克隆抗体 用于皮革制造业，提高皮制品的质量 鉴定鱼翅制品真假的辅助手段 利用Chsase制备低分子量的CS，不仅具有科研意义，更有其实用意义。世界上一

7、些发达国家正积极致力于利用酶解法开发LMCS的研究而国内却鲜有研究,1 蔡苏兰，阎浩林，何汉洲. 微生物硫酸软骨素裂解酶的研究进展J. 沈阳药科大学学报. 2004(01): 76-80. 2 苏昕，周丽娜，梁丽莉. 发酵法制备硫酸软骨素裂解酶及其酶分离纯化的研究J. 微生物学杂志. 2005(04): 64-67. 3 蔡苏兰. 硫酸软骨素裂解酶的研究D. 沈阳药科大学, 2004. 4 李晔，陈振娅，袁其朋. 硫酸软骨素裂解酶 ABC 的研究进展 J. 生物工程学报.2015. 5于淼, 硫酸软骨素酶的发酵制备与分离纯化. 2013, 中国海洋大学. p. 60. 6牛海滨, 硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶固定化方法的研究. 2009, 沈阳药科大学. p. 76. 7蔡苏兰, 硫酸软骨素裂解酶的研究. 2004, 沈阳药科大学. p. 84. 8陈秀菊, 硫酸软骨素酶ABC型分泌型真核细胞表达质粒的构建. 2007, 天津医科大学. p. 45. 9付静芸, 产硫酸软骨素酶菌株的筛