基因工程的基本原理和技术.ppt

1、教学目标,知识与能力 1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、 教学重点和难点 1.教学重点： DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 2.教学难点: 基因工程载体需要具备的条件。,基因工程,每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,抗虫害的玉米,转基因鲑鱼,基因工程产品,基因工程的产物,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生长激

2、素的转基因牛(阿根廷),什么叫基因工程？,基因工程又叫DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（一）基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切, 拼接, 导入, 表达,按照预先设计的蓝图，定向改变生物遗传特性，创造出新型生物,基因工程研究的理论基础,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,科技探索之路,早期基础理论,

3、摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术的发展催生了基因工程,DNA是遗传物质的证明 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译（

4、遗传密码的通用性） 基因运载体的发现 工具酶的发明 DNA合成和测序技术的发明 DNA体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 第一例转基因动物问世 PCR技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝纫针” DNA连

5、接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝纫针” 基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1、主要来源： 2、特点： 3、作用：,识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列（不同的限制酶能识别不同特点的核苷酸序列），并且以不同的方式在两个特殊碱基之间切断DNA双链。,主要从微生物中分离纯化,使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,磷酸二酯键,H2O +,4、限制酶识别序列,Go on,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,限制酶的

6、识别序列：,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,Go back,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,Go back,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端

7、？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC CTTAAG,酶切,GAATTC CTTAAG,同一种,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,二、“分子缝合针” DNA连接

8、酶,作用:,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,DNA连接酶“分子缝纫针”,连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 Ecoli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连

9、接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,导入过程需要运输工具运载体。,三、基因进入受体细胞的运载体”分子运输车”,运载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。

10、 作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,如果载体对受体细胞有害将怎样？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,作为运载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去; 5) 载体

11、DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.,常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶,A,课堂练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,课堂练习,3.以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,课堂练习,种类与命名：,现在已经从约3