恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达

1、恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达张军红1，李 青2，王春华3，吴秀云3，卢新阁3，王莉菲4，杨蕾蕾1，王秋红5(河北省眼科医院，河北省眼科研究所，1病理科， 3耳鼻喉科，4河北省眼科学重点实验室，5检验科，河北省邢台市 ；2贵阳医学院附属医院骨科，贵州省贵阳市 )引用本文：张军红，李青，王春华，吴秀云，卢新阁，王莉菲，杨蕾蕾，王秋红. 恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达J.中国组织工程研究，2016，20(23):3374-3379.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.004 ORCID: 0000-0002-5551-93

2、15(张军红)文章快速阅读：肿瘤干细胞标志物CD34在鼻咽癌细胞增殖和转移中的作用张军红，女，1974年生，河北省邢台市人，汉族，2009年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事癌症的发病机制和临床病理相关性研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)23-03374-06稿件接受：2015-04-13鼻咽癌细胞系FACS分析CD34在4种鼻咽癌细胞系中的表达MTT分析CD34+和CD34-细胞增殖能力FACS分离CD34+和CD34-细胞划痕实验分析CD34+和CD34-细胞迁移能力克隆形成能力分析CD34+和CD34-细胞增殖能力 文题释义：肿瘤干细胞

3、假说：是近年提出的肿瘤发生的新理论，目前已经在白血病、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、脑癌等肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。近年来的研究结果支持肿瘤干细胞具有转移和抗放化疗的特点。CD34分子：最初发现是特异性表达在人类造血干细胞表面高度糖基化型跨膜蛋白。随着对CD34的深入研究，发现CD34特异性表达在白血病、结直肠、脑瘤和头颈癌等肿瘤干细胞表面，可作为表面标志分子分离肿瘤干细胞。对CD34在广度和深度的深入研究，可能对于癌症的诊断和治疗有重要意义。摘要背景：在多种肿瘤中已证实CD34与肿瘤的发生、发展、复发、转移、耐药密切相关，但是CD34与鼻咽癌的关系目前还知之甚少。目的：分选鼻咽癌细胞株中CD34+

4、与CD34-细胞的增殖和迁移能力。方法：利用流式细胞术检测CD34在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的表达，根据细胞表面标志物分选出CD34+与CD34-细胞，进行纯度鉴定；通过体外MTT法、平板克隆形成实验以及划痕实验分析CD34+细胞与CD34-细胞增殖和迁移能力。结果与结论：4种鼻咽癌细胞株中CD34表达均恒定在0.1%-0.2%，且CD34水平与细胞的生长密度关系密切；分选的CD34+细胞群中，CD34+细胞例能达到98%以上，在CD34-细胞群中未能检测到CD34+细胞；CD34+细胞在第1，3，5，7天增殖速度显著高于CD34-细胞(P 0.05)；CD34+

5、细胞克隆形成率显著高于CD34-细胞(P 0.05)；CD34+细胞向划痕区迁移的细胞明显多于CD34-细胞(P 0.05)；结果提示，CD34+细胞体外培养具有更高的增殖和转移能力，具有鼻咽癌肿瘤干细胞潜能。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；鼻咽癌；肿瘤干细胞标记物；CD34主题词：鼻咽肿瘤；肿瘤干细胞；抗原, CD34；组织工程基金资助：邢台市科技支撑计划(2013ZC062)CD34, a cancer stem cell marker, in nasopharyngeal carcinoma cell linesZhang Jun-hong1, Li Qing2, Wang Chun-hua

6、3, Wu Xiu-yun3, Lu Xin-ge3, Wang Li-fei4, Yang Lei-lei1,Wang Qiu-hong5 (1Department of Pathology, 3Department of Otolaryngology, 4Key Laboratory of Ophthalmology of Hebei, 5Laboratory, Ophthalmic Hospital of Hebei, Ophthalmic Institute of Hebei Province, Xingtai , Hebei Province, China; 2Department

7、of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guiyang Medical University, Guiyang , Guizhou Province, China)AbstractBACKGROUND: Previous research have confirmed that CD34 is closely related to oncogenesis, progress, recurrence, metastasis and drug-resistance of various cancers, but its role in nasopharynge

8、al carcinoma remains unclear.OBJECTIVE: To sort cells positive and negative for CD34 in nasopharyngeal carcinoma cell lines and to detect cell proliferation and migration.METHODS: Expressions of CD34 in nasopharyngeal carcinoma cell lines 5-8F, 6-10B, CNE1 and CNE2 were detected by flow cytometry. A

9、nd CD34+ and CD34- cells were sorted based on cell surface markers for purity identification. Afterwards, proliferation and migration of CD34+ and CD34- cells were detected by MTT assay, colony-formation assay and scratch assay.RESULTS AND CONCLUSION: All four nasopharyngeal carcinoma cell lines exp

10、ressed CD34 in 0.1%-0.2%, and the level of CD34 was closely related to the cell growth density. The purity of CD34+ cell was more than 98% in the sorted CD34+ cell populations, but no CD34+ cells were found in the sorted CD34- cell populations. At 1, 3, 5 and 7 days the proliferation rate of CD34+ c

11、ell, populations was significantly higher than that of CD34- cells (P 0.05). Consistently, the colony-formation efficiency of CD34+ cell was significantly higher than that of CD34- cells (P 0.05). Moreover, CD34+ cells migrated significantly faster than CD34- cells by scratch assay (P 0.05). In conc

12、lusion, CD34+ cells cultured in vitro display higher proliferation and migration capacities, indicating that CD34+ cells have the potential of nasopharyngeal carcinoma stem cells. Subject headings: Nasopharyngeal Neoplasms; Neoplastic Stem Cells; Antigens, CD34; Tissue EngineeringFunding: the Scienc

13、e and Technology Support Program of Xingtai, No. 2013ZC062Cite this article: Zhang JH, Li Q, Wang CH, Wu XY, Lu XG, Wang LF, Yang LL, Wang QH. CD34, a cancer stem cell marker, in nasopharyngeal carcinoma cell lines. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(23):3374-3379.Zhang Jun-hong, Attending phy

14、sician, Department of Pathology, Ophthalmic Hospital of Hebei, Ophthalmic Institute of Hebei Province, Xingtai , Hebei Province, China0 引言 Introduction鼻咽癌是中国南方地区发病率较高的恶性肿瘤，且机体发病早期未得到有效治疗，将会诱发其他疾病。另外，鼻咽部位淋巴组织相对丰富，发病早期即可以发生癌细胞的转移。鼻咽癌的常规方法主要以放疗为主，但是临床死亡率高1。数据显示，中国鼻咽癌患者5年生存率仅有50%，而转移及复发是其死亡率的主要原因2-3。从大的

15、角度来说，肿瘤属于单克隆来源4-5，但是来源于同一克隆的肿瘤细胞之间也存在较大的差异，如表型、功能等，导致肿瘤细胞存在明显的异质性。肿瘤细胞群内存在较多具备干细胞特性的肿瘤细胞，它们在肿瘤的发生、发展以及治疗预后中发挥了重要的作用6。因此，分离、鉴定不同类型肿瘤干细胞，并了解其生物学特性，对鼻咽癌基因治疗具有重要的意义7。国外学者提出肿瘤的生长与肿瘤周围血管的生成存在紧密的联系，血管能够为肿瘤生长提供足够的养 料8-9。CD34标记的不同肿瘤平均微血管密度存在明显的差异10-11。近年来，有学者从急性髓系白血病细胞系中分离出白血病干细胞12-13，免疫磁珠分选获得的CD34+ CD38-细胞经

16、克隆形成实验，证实了该群细胞具有白血病干细胞的特性，由此看出CD34+可能是肿瘤干细胞的表面标志物之一。但是，CD34在鼻咽癌中的表达以及自身的生物学特性尚缺乏报道14。为此，实验选取鼻咽癌细胞系作为研究对象，探讨恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系中的表达，分析CD34在鼻咽癌发生、发展和转移中扮演的角色，能够为鼻咽癌靶向治疗提供新的靶标，对提高鼻咽癌患者的生存期具有重要意义15。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 组织基础分析。1.2 时间及地点 于2014年10月至2015年10月在河北省眼科医院完成。1.3 材料 细胞株：人鼻咽癌细胞株5-8

17、F、6-10B、CNE1、CNE2购自中科院上海细胞库16-17。 检测恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系中表达所用主要试剂和仪器：试剂及仪器来源RPMI1640培养基Hucilne公司新生牛血清和胎牛血清杭州四季青公司超低温冰箱日本三洋公司恒温循环水浴锅Pharamcia公司二氧化碳培养箱美国Harris公司电子天平德国GE公司生化培养箱广东省医疗器械厂流式细胞仪BDAria公司Milli-Q纯水器美国Millipore公司1.4 实验方法1.4.1 鼻咽癌细胞的培养分离 4种鼻咽癌细胞株均采用含体积分数为10%新生牛血清的RPMI1640培养基，在37 、体积分数为5%CO2、饱和

18、湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验18。1.4.2 流式细胞仪直接免疫荧光法检测CD34的表达 取贴壁生长、状态良好细胞制作单细胞悬液，计数1106个细胞，PBS冲洗1次，用PBS将终体积定为100 L，加入PE标记的小鼠抗人CD34单克隆抗体，并且在对照细胞中加入同型抗体，避光放置30 min，PBS冲洗2次，用流式细胞仪测定荧光值19-20。1.4.3 细胞分选及纯度鉴定 以CNE2细胞株为研究对象，采用流式细胞术分选出CD34+和CD34-细胞，流式细胞仪检测分选细胞的纯度。收集103个分选的细胞加入petri皿中，避光静置20 min，待细胞沉底后在激光共聚焦显微镜下检测

19、CD34+和CD34-细胞纯度21。1.4.4 MTT和平板克隆实验分析细胞增殖能力MTT比色实验：将上述从CNE2细胞分离的CD34+和CD34-细胞接种于96孔培养板中，每孔200 L，设置空白对照组(仅加培养基)，培养1，3，5，7 d，每孔中加入20 L 5 g/L MTT溶液，常温培养4 h，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜150 L，室温孵育10 min，振荡10 min使结晶物充分溶解，酶标仪上测定490 nm波长处各孔吸光度值。平板克隆形成实验：将上述从CNE2细胞分离的CD34+和CD34-细胞接种于6孔培养板中，每孔300个细胞，轻轻摇晃培养板，保证细胞分散均匀，在37

20、、体积分数为5%CO2培养箱中培养2周，待出现细胞克隆时终止培养，弃去培养液，采用D-Hanks液冲洗2次，苏木精染色15 min，流水洗去染液，空气干燥后在显微镜下计数细胞克隆数22-23。克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数100%。1.4.5 划痕实验分析细胞迁移能力 将上述从CNE2细胞分离的的CD34+和CD34-细胞接种于96孔培养板中，每孔5103个细胞，轻轻摇晃培养板，保证细胞分散均匀，每孔加入500 mL含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基，待细胞贴壁生长后换成体积分数为2%小牛血清培养基继续培养，采用1 mL的Tip头在孔内划出一垂直线，用D-Hanks清洗掉划

21、下的细胞，倒置显微镜拍照，48 h后再次拍照，观察CD34+和CD34-细胞的迁移情况24-25。迁移率=细胞迁移后划痕的距离/开始划痕的距离100%。1.5 主要观察指标 鼻咽癌细胞株中CD34的表达。CD34+和CD34-细胞纯度。细胞增殖能力和迁移能力。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行数据分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 鼻咽癌细胞株CD34的表达 流式细胞仪检测了4种人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中CD34表达情况，结果显示：4种

22、鼻咽癌细胞株中CD34表达均恒定在0.1%-0.2%，且CD34水平与细胞的生长密度关系密切，当细胞完全贴壁生长后，CD34表达水平能够达到0.2%。2.2 鼻咽癌细胞株中CD34+和CD34-细胞分选和纯度 用流式细胞分析仪分选出CD34+和CD34-细胞，并对其进行分选纯度分析，结果显示：分选的CD34+细胞群中，CD34+细胞比例能达到98%以上，在CD34-细胞群中未能检测到CD34+细胞。激光共聚焦显微镜下见98%以上CD34+细胞膜发出红色荧光(图1A)，而CD34-细胞未能检测到荧光(图1B)。2.3 CD34+和CD34-细胞增殖能力 MTT实验结果显示从CNE2细胞分离的CD

23、34+细胞在第1，3，5，7天增殖速度显著高于CD34-细胞(P 0.05)，见表1。表1 MTT法检测CD34+和CD34-细胞增殖能力 (s，吸光度)Table 1 The proliferation ability of CD34+ and CD34- cells detected by MTT assay指标第1天第3天第5天第7天CD34+0.3500.0430.8720.0171.2300.0571.8410.043CD34-0.2490.0380.2420.0610.5130.0620.6610.064t19.2822.4119.7720.49P 0.05 0.05 0.05 0

24、.05从CD34+和CD34-细胞增殖曲线可以看出，CD34+和CD34-细胞均处于上升趋势，但CD34+细胞增殖速率显著快于CD34-细胞(P 0.05)，见图2。2.4 平板克隆实验 从CNE2细胞分离的CD34+细胞克隆形成率(91.3333.909)%显著高于CD34-细胞(27.3844.931)%，差异有显著性意义(P 0.05)。CD34+的克隆形成能力显著优于CD34-细胞，见图3。2.5 体外迁移能力 划痕实验显示从CNE2细胞分离的CD34+细胞向划痕区迁移率(19.564.88)%明显小于CD34-细胞(59.572.36)%(P 0.05)。CD34+的迁移性能显著优于

25、CD34-细胞，见图4。3 讨论 Discussion鼻咽癌的发病率较高，它是中国南方及东南亚地区常见的上皮组织恶性肿瘤26-27。由于鼻咽部位淋巴组织相对丰富，发病早期容易发生转移，且对化疗并不敏感，5年生存率仅有50%，成为鼻咽癌患者死亡的主要原 因28-29。研究显示，CD34+肿瘤细胞与肿瘤发生、侵袭、耐药和复发存在紧密的联系30，但是在鼻咽癌中研究相对较少。CD34基因主要由8个外显子构成，它是一个分子质量为105-120 ku的跨膜细胞表面糖蛋白，可选择性在人造血系统的干/祖细胞中表达，也可在血管内皮细胞及其他组织中表达。CD34具有黏附功能，对血管内皮细胞有较高的特异性，能够与血

26、管内皮细胞相互结合，提高内皮细胞的化学趋化性，促进血管内皮的分裂及毛细血管的出芽生长，诱导蛋白溶解酶的生成，促进新生血管的生成31-32。实验检测了CD34在4种人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的表达情况，并根据CD34单克隆抗体的荧光标记，分选出CD34+与CD34-细胞。结果显示，4种鼻咽癌细胞株中CD34表达均恒定在0.1%-0.2%，且CD34水平与细胞的生长密度关系密切，当细胞完全贴壁生长后，CD34表达水平能够达到0.2%。以上结果说明在鼻咽癌细胞株中只有微量的细胞表达CD34，提示CD34有可能作为鼻咽癌细胞干细胞标志物。通过激光共聚焦技术及流式细胞仪对所

27、分选细胞进行纯度分析33-35，结果显示：分选的CD34+细胞群中，CD34+细胞比例能达到98%以上，在CD34-细胞群中未能检测到CD34+细胞。激光共聚焦显微镜下见98%以上CD34+细胞膜发出红色荧光，而CD34-细胞未能检测到荧光，以上结果说明分选的CD34+与CD34-细胞纯度都较高。体外实验分析CD34+细胞与CD34-细胞体外增殖、分化和迁移能力，CD34+细胞在第1，3，5，7天增殖速度显著高于CD34-细胞(P 0.05)，由此看出CD34+细胞体外增殖能力显著强于CD34-细胞。CD34+细胞克隆形成率及迁移距离显著多于CD34-细胞(P 0.05)。由此看出，CD34不

28、仅与鼻咽癌细胞的增殖能力有关，还与鼻咽癌细胞的迁移能力存在紧密的联系36-37。国外研究显示，CD34可能与黑色素瘤细胞的迁移能力关系密切，通过RNA干扰技术抑制黑色素瘤细胞CD34的表达38，且干扰后细胞会随着干扰效率的增加其增殖速度相应降低，体内及体外迁移能力也得到进一步减弱。由此看出，鼻咽癌细胞株中CD34+与CD34-细胞生物学特性差异显著，CD34是否能作为鼻咽癌干细胞的分离标志，尚需要进一步研究和分析39-40。致谢：感谢河北省眼科医院重点实验室提供实验场地。作者贡献：张军红负责设计实验方案，李青、王春华负责收集资料和采集实验标本，吴秀云、卢新阁负责实验实施，王莉菲、杨蕾蕾负责审核

29、。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：鼻咽癌细胞系购自中科院细胞库，无伦理问题。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。2.01.51.00.50 B ACD34+细胞CD34-细胞吸光度值0 d 2 d 4 d 6 d 8 d图3 CD34+和CD34-细

30、胞克隆形成能力Figure 3 The differentiation ability of CD34+ and CD34- cells detected by colony-formation assay150100500克隆形成率(%)CD34+细胞 CD34-细胞图1 激光共聚焦显微镜进行CD34+和CD34-鉴定(100)Figure 1 Identification of CD34+ and CD34- cells by laser scanning confocal microscope (100)图注：图中A为CD34+细胞在激光共聚焦显微镜下显示红色荧光；B为CD34-细胞在激

31、光共聚焦显微镜下不能检测到红色荧光。图4 CD34+和CD34-细胞迁移能力Figure 4 The migration ability of CD34+ and CD34- cells detected by scratch assay806040200迁移率(%)CD34+细胞 CD34-细胞图2 CD34+和CD34-细胞增殖曲线Figure 2 The proliferation curves of CD34+ and CD34- cells detected by MTT assay4 参考文献 References1 庞霞,郑湘予,李晟磊,等.CD31、CD34和CD105蛋白在食

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