TK1检测项目指导手册

1、 第一部分 项目运行意义概述胸苷激酶1简称TK1，是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物；它参与DNA补救合成途径,是DNA合成的特殊标志酶。临床上,可用于监测和评估体内细胞的异常增殖速度。 健康人细胞多处于静止状态（非增殖细胞），血清中的TK1酶含量极微，而随着增殖类疾病的发生，尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中TK1酶的含量出现显著升高，超过健康人平均水平2倍甚至100倍以上。所以，通过检测血清中TK1浓度水平的变化，能够敏感地发现细胞增殖异常，动态评估细胞增殖发展趋势，为提前干预治疗高风险癌前病变，遏制肿瘤进程提供重要信息。 在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖

2、评审机构)二十多年的研发基础上,华瑞同康生物技术（深圳）有限公司与瑞典Karolinska大学TK1研究团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶1（TK1）细胞周期分析试剂盒及CIS系列化学发光数字成像仪，该系统是世界上唯一用于临床检验血清中TK1浓度的产品，其特异性高于95%,对各类增殖性疾病的综合检测灵敏度高于70%。该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用： 1、独立的肿瘤预后因子：多国家，多机构的研究表明，TK1是优选的预后评估指标，可作为独立的肿瘤预后因子；2、动态评估手术、放化疗效果：能够对各种实体肿瘤（例如：肺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌等）以及白血病和淋巴癌

3、患者的治疗效果进行评估，为治疗方案的改善提供参考；3、更早评估肿瘤复发风险：对肿瘤康复期患者进行动态跟踪，较影像学更早提示肿瘤复发或转移风险信号；4、评估各类增殖类疾病恶变风险：处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。基于TK1与细胞增殖的密切关系，能够灵敏地通过TK1的浓度变化，发现恶性增殖风险，为肿瘤的癌前干预提供了更有效率，更有价值的信息，适用于无疾病人群的恶性增殖风险筛查。第二部分 项目运行准备一.项目环境1、 环境参数温度： 24-25；湿度：小于65%；实验用水：（1） 双蒸水；（2） 去离子水；2、 实验室设置要求：（1） 项目最小占地约8-9平方米；（2） 工作区域可放置两

4、张1.5m0.8m或一张3m1m工作台；（3） 控温设备：30立方米左右的独立空间，可选用2匹的挂式空调进行控温,或选用恒温摇床，如下图：二、项目所需设备1、实验用设备编号设备名称规格要求数量用途1化学发光数字成像分析仪CIS系列1采集发光信号和分析数据2脱色/恒温摇床（平摇）20-100r/min可调1免疫孵育3台式离心机0-4000r/min1分离血清4冰箱冷藏2-8冷冻-201保存试剂保存样本5打印机USB数据接口1输出检测结果6恒温水浴锅单孔或双孔1控制反应液温度 2、实验工具及耗材 （1）实验用工具：编号工具名称规格要求数量用途1移液器0-10l或1血清点样2移液器20-100l1配

5、制反应液3移液器100-1000l1分装和检测样本4试剂瓶500ml2配制工作液6烧杯100ml2配制工作液7电子计时器无1实验提醒8探头温度计-50-501控制实验温度9塑料镊子平头1实验需要10反应盒24T、48T、96T各1适用于对应规格的产品使用11量筒25ml1配制工作液12量筒250ml1配制工作液（3） 实验耗材编号耗材名称规格要求用量用途1移液器枪头20l1个/样本配套0-10l移液器使用2移液器枪头200l2个/次配套20-100l移液器使用3移液器枪头1ml1个/次配套100-1000l移液器使用4分装管500l或1ml1个/样本血清分装时使用5吸水纸无-保持环境清洁，防止

6、膜污染6精密PH试纸5.5-9.0-测定缓冲液PH值三、实验样本处理要求及保存样本种类：血清采集要求：1、 必须使用无任何添加剂的真空采血管；2、 取静脉血2ml（室温）；3、 建议空腹采血；4、 脂血、溶血样本可能造成实验结果的偏差，不建议使用；样本处理： 1、 采血完成后，室温下静置或37水浴至凝固后离心使用；2、 离心转速：4000r/min，离心时间：5min；注：室温放置时间不宜超过3h；样本保存：1、 离心后的血清如非即时使用，应立即分装，推荐血清分装量100-200l/管，放置于-20保存；2、 -20保存时间以不超过7天为佳；3、 如需长时间保存，建议提高分装量（1.5ml），

7、并放置于-80（可保存3年左右）；样本运输：1、 样本如需外送检验（本市范围内或行程小于3小时），建议采血后先放置于2-8静置，到检验点后取出离心，处理要求同上；2、 样本如需外送检验（外省市），建议离心后分装至分装管中，血清分装量1.5ml/管，运输介质建议使用保温箱+化学冰+干冰，干冰用量 2公斤/24小时（根据路程耗费时间增量）；样本复融：1、 血清使用前需充分振荡混匀；2、 冷冻保存的血清样本，需放置于室温完全解冻后使用；3、 反复冻融的血清样本严禁使用。第三部分 项目核心产品简介一、胸苷激酶1细胞周期分析试剂盒注 册 号：粤食药监械（准）字2014第号规 格：24人份、48人份、96

8、人份储存条件：2-8有 效 期：6个月（具体日期见试剂盒标签）使用要求：开封后一次性使用实验用时：单次实验用时5-6h（根据样本数量有所差别）；工作通量：300-400人份/天图1主要组成成份：试剂盒由校准品、抗TK1-IgY、生物素化抗IgY二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、封闭剂、硝酸纤维素膜主要成分组成。组分名称、装量详见产品说明书，并以产品说明书为主。二、CIS系列化学发光数字成像分析仪注 册 号：粤食药监械（准）字2011第号1、设备性能参数系统偏差：5%成像灰度等级：12bit(212)分辨率：1392（H）1040（L）光学镜头：几何形变率小于1%拍

9、摄范围： 12cm9cm可调工作环境温度：10-30单次批处理能力：96人份/次读出噪音：7 e-rms20MHz降噪能力：专业级高效半导体制冷CCD，集成噪音软处理功能2、主要结构部件 CIS-2化学发光数字成像分析仪、免疫点印迹分析软件、加密狗、Lenovo一体机。 图2第四部分 项目实验操作一、项目原理概述1、TK1检测：先将含有TK1抗原血清吸附在硝酸纤维素膜固相载体上，用抗人TK1-IgY抗体识别抗原（A），生物素化抗IgY二抗识别抗原-抗人TK1-IgY抗体并进行信号放大（B），亲和素化辣根过氧化物酶与生物素连接（C），在加入发光底物后，亲和素化辣根过氧化物酶催化底物发光，发出的光

10、信号强弱光信号（D），必须通过CCD的信号采集设备进行采集和分析。（如图3） 图32、实验结果分析： 将反应完毕的样本载体，放入暗室（避免外界光的干扰），通过精密的制冷CCD长时间曝光将化学发光强弱信号转变为数字信号，保存后得到样本发光图片，通过校准品固定浓度与亮度的关系，绘制标准曲线，进而计算出其他样本TK1的浓度。二、实验操作流程1、实验准备部分：1.1血清准备：请参照实验样本处理要求及保存章节；1.2 试剂工作的最佳温度为25-26，请使用空调和恒温水浴锅等保证实验工作液温度达到该标准；1.3 实验前需仔细清洗玻璃器皿：洗涤液清洗清水冲洗实验用水润洗1.4 检测实验用设备和工具是否都处于

11、正常工作状态（包括化学发光数字成像分析仪），对于发现的异常情况进行及时排除；1.5 按照说明书要求配制实验所需的稀释液和洗涤液，保证配制好后的pH值在7.2-7.8之间；2、实验操作控制1、 点样：取出点样板，为防止污染在点样板下放一张白纸，样本上样量为 3l；a.取样后，枪头贴壁2-3次；b.加样枪垂直；c.扶稳加样枪，枪头固定于孔中央；d.保证样本打出后直接被膜吸附；2、 晾干：将膜从点样板中取出，揭掉背面蓝色保护膜，放置于温度28-30，湿度小于65%的环境进行晾干，时间为30min；3、 漂洗：待膜晾干完毕，将膜放入反应盒，倒入双蒸水或去离子水，使膜浸没于水中，以60-70r/min的

12、转速洗涤2次，每次1min;4、 封闭：封闭剂使用稀释液配制（3g封闭剂+50ml稀释液）；使用磁力搅拌器混匀5min（或用手快速搅匀10-15min），至没有封闭剂颗粒和沉淀为止；将晾干后的膜放入反应盒中，倒入封闭剂；以35-45r/min的转速摇动，时间为30min；5、 抗TK1-IgY抗体反应：将封闭液摇匀（盒底无沉淀）后倒出，然后加一抗反应液（一抗稀释浓度见试剂盒内说明书），并以400l封闭剂/10ml反应液的比例添加封闭剂；以35-45r/min；反应2h；反应液温度控制在25左右；6、 洗涤：倒去一抗反应液，先用洗涤液迅速漂洗两次，再倒入洗涤液以60-70r/min的转速洗涤3次

13、，每次5min；7、 生物素化抗IgY二抗：按说明书稀释倍数进行稀释， 35-45r/min反应40min；反应液温度控制在25左右；8、 洗涤 同69、 SA-HRP：按说明书稀释倍数进行稀释， 35-45r/min反应60min；反应液温度控制在25左右，10、洗涤 同611、ECL发光：取出洗涤好的膜，在吸水纸上控干后放在发光盒中，将ECL1、2液混合后均匀倒在膜上，计时反应1min，反应完成后，立即开始倒计时5min，将膜夹入压膜片中，用滚筒压平，放入化学发光仪中调整位置（十字交叉中心），关闭暗箱门，5min倒计时结束后进行拍摄。三、实验结果分析1、工作前准备： 1.1连接好电源，启动

14、设备（可在拍摄前5min启动）； 1.2运行免疫点印迹分析软件；在登录界面输入用户、密码后，进入软件操作页面（异常情况1）。2、实验结果获取流程 2.1预拍 将实验膜片放入化学发光仪中调整位置（十字交叉中心），关闭样本台；点击工具栏“系统”选择“读取CCD”，或者点击快捷按钮单击“预拍”。2.2 实验图像的获取： 预拍结束后点击“读取图像”，即开始读取图像，读取完毕后会弹出“实验图片拍摄完毕，请取出模板”的提醒（异常情况2），取出膜片后，重新关闭样本台，点击“读取背景图像”，倒计时结束后点击“应用”； 2.3实验图像的处理 点击“应用”，软件即会对图像自动进行背景扣除并自动压缩显示范围，生成结

15、果图像，点击“关闭”关闭CCD对话框。2.4实验图像的保存 点击“图像”“另存待分析图像（pwk）”，或快捷按钮，选择保存位置保存待分析图像后关闭图像，所保存的文件后缀名为“pwk”，保存后关闭分析仪电源。建议：每天的实验结果建议保存在独立的文件夹，文件夹命名规则：实验时间+试剂批号，例如：-NTA图43、图像分析操作方法 3.1新建实验和工作图像的获取 点击“实验”“新建实验”，或快捷按钮，打开新建实验对话框，填写实验名称、报告人、审核人等，点击“确定”；点击“实验”“导入数据”“打开待分析图像”，或直接点击快捷按钮，在弹出的对话框中找到2.4中保存的pwk文件，点击打开即可进入分析。3.2

16、工作图像的分析 “图像”“反视”，或直接点击快捷按钮根据斑点数的多少，点击上下箭头选取合适的模板如46，再点击右侧的“显示模板”按钮，如需不同尺寸的模板框可选择“其它”,在弹出的“自定义模板尺寸”对话框中选择合适的“行数”“列数”，然后点击“保存，打开模板后利用上下左右箭头移动(快速移动同时按下“ctrl+方向键”) 使得所有斑点刚好都在选框内，框好点击快捷按钮“计算” ,在弹出对话框中选“yes”，软件将自动进行计算，计算结束按下图样式将原始图像、工作图像、线性图和数据四个图表显示。图5四、实验结果评价1、实验亮度标准1.1 实验亮度查看方法：在完成3.1实验图像处理后，点击工具栏“实验”“

17、重置raw原始文件”出现“编辑原始Raw图像”对话框，单击“范围压缩”在最小值为“0”的情况下，最大值则代表实验亮度水平（异常情况3、4）。1.2 实验亮度水平判断标准 由于CCD有本底的电子噪音，当实验结果的亮度水平低于50时，会使样本的计算结果产生比较大的偏差。 2、校准品线性标准2.1 校准品线性的查看方法： 在工作图像分析完成后， “线性”窗口上方会显示：R=X.X（如图5），R即代表校准品线性；2.2 校准品线性的评价标准 线性的好坏反应了校准品亮度与浓度的对应关系，R值越接近于1，对应关系越好，在实验控制时，要求R0.99。（异常情况5）。五、实验操作常见问题异常情况1：提示无法检

18、测到加密狗 处理建议：重新安装加密狗驱动。 点击图标文件进行加密狗安装，出现如下图6所示时，需选择驱动类型：图6一体机有USB口，使用USB加密狗，选择USB狗驱动,再点击安装。异常情况2：CCD读取图像时超时，且不出现拍摄结束提示情况分析：内存使用率高，造成读取CCD图像时出现的假死现象处理建议：请勿重新启动或强行关机，多耐心等候12分钟，内存读取正常后，会弹出提醒框，可进行后续操作异常情况3：背景消除后，仍未看到明显的样本点情况分析：1、设备长时间未使用，造成本底电荷较多未能够清除；建议：（1）每次拍摄前，进行“预拍摄”，可达到去除过多本底电荷的效果； （2）按照查看实验亮度的方法，调出“

19、范围压缩”对话框，降低最大值数值，直至能够清晰看到样本点，重新保存图片进行分析。 2、在上述两种方法调整仍未见样本时，可能出现了实验操作错误（抗体添加顺序错误或漏加抗体、拍摄时未取出膜片等）造成的无发光结果，请回想实验过程，并计划实验重做。异常情况4：实验亮度偏低实验图像处理后，亮度水平达不到标准（图7）：图7：左：亮度22（亮度异常）右：亮度98（亮度正常）1、可能原因及解决方法： A配置好的反应液温度低于25；建议：当冬季或测量反应溶液低于要求时，尽量使用水浴锅为反应溶液保温； B、由于晾干温度或湿度问题造成的晾干不充分； 建议：晾干温度保证在28-30，湿度不超过65%，如果温度难以保证

20、，可适当延长晾干时间，以膜完全干透为准； C、移液器或枪头问题造成抗体配置比例偏差大；建议：1、移液器定期校准；2、使用进口枪头； D反应器皿或其它污染造成抗体效价降低： 建议：1、实验前仔细清洗反应器皿；2、实验工作液当天配置当天使用；3、检查排除实验室是否存在其它有机气体污染；E实验用水不合格，存在污染： 建议：定期对净水器进行检查，清洗、消毒储水桶，使用合格用水。 异常情况5：校准品点样顺序错误当实验人员由于点样不慎，造成如下图的结果时：图8（左）：校准品2、3顺序错误图9：（下）修改前，（左下）修改后先按照正常流程计算结果，分析结束后再进行调整。操作步骤：点击“工作图像”的标题栏处激活

21、相关菜单功能，点击菜单栏“斑点”“区域”“椭圆”，在工作图像上圈定A2，再点击“斑点”“编辑斑点”，在弹出的新斑点中填入A3、1行、3列。填写完毕后点击“确定”，弹出询问框选择“yes”，操作成功会弹出“操作成功”按“OK”确认,同样的方法将A3修改为A2。再点击“实验”“显示实验结果”，软件将重新进行计算并将结果重新显示，得到如图9结果。第五部分 项目应用介绍一、临床应用 1、临床应用价值（1）基于不同类型肿瘤和个体细胞异常增殖度的差异，血清TK1浓度测验真实评估细胞异常增殖病变的进展；（2）通过对肿瘤细胞增殖度水平检测，进行肿瘤患者预后评估；（3）提示康复期患者癌细胞增殖异常变化，预测复发

22、风险。（4）动态监测手术及放化疗期间肿瘤细胞增殖速度状态的变化，为个体化治疗方案制定提供重要信息； 2、临床跟踪方法及评估标准 （1）手术+化疗监控方案治疗方案样本采集时间选择1新辅助化疗化疗前1天；化疗开始后（2-3）天；化疗结束后，手术前1天；手术后1个月；手术后3个月；手术后6个月；2术后（放疗后）化疗术前1天；化疗前1天；化疗开始后（2-3）天；第2疗程开始前1天；第3疗程开始前1天；第4-6疗程开始前一天；3姑息性化疗化疗前1天；化疗开始后（2-3）天；化疗间歇期，下个疗程开始前1天；治疗结束后1个月；治疗结束后3个月；治疗结束后6个月；（2）手术+放疗+化疗监控方案治疗方案样本采集时间选择1 手术前放疗（或放化疗联合）放疗前1天；放疗开始后（2-3）天；放疗结束后，手术前1天；手术后1个月；手术后3个月；手术后6个月；2 手术后放疗（