南方医科大学 肝糖原提取 2015级临床医学二 第3实验室

1、 生物化学实验报告 名： 姓 号：学 级第二临床医学院 专业年级： 临床医学 实验室7 组别：第 生物化学与分子生物学实验教学中心 肝糖原的提取、鉴定、分离 实验名称 7实验室实验地点实验日期 2016-12-29 第 陆远芳 指导老师 评分 教师签名 批改日期 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法并了解相关注意事项。、掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和操作2 方法以及相关注意事项 、掌握正确使用可调微量取液器与刻度吸管的方法。3 。4、正确行使溶液转移作业 正确用法。、掌握分光光度计的5 二、实验原理 1、肝糖原提取低浓储存于肝细胞内的糖原在对肝细胞采用淹没匀

2、浆等方法破碎细胞并在能稳定度的三氯醋酸环境中让肝组织中的酶被破坏、蛋白质被沉淀析出后，糖原溶于热水而不溶于乙地保存在上清液中。以此让糖原与其他组分分离。 乙醇沉淀绿叶中的糖原，再溶于热水中。醇，故先用95% 、糖原的鉴定2。糖原葡萄糖长链分子间引力吸附碘糖原水溶液为乳样光泽，遇碘变红棕色分子后呈现出的颜色。糖原尚可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖 的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 反应式如下： + Cu(OH)SO + 2NaOH = NaCuSO2 424O + HHO = 2CuOH + 氧化型葡萄糖2Cu(OH) + C212626红色)0 + Cu O (2CuOH = H

3、22Cu(OH) = HO + CuO (黑色) 223、肝糖原定量 浓酸中，糖原水解成葡萄糖，浓硫酸使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物，即5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处呈现最大吸收峰。糖含量于10100mg范围内时，溶液颜色的深浅正比于可溶性糖含量。利用此反应下的实验现象与同样处置后的已知糖含量的葡萄糖标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中稳定，故在显色之前，肝组织宜先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 三、实验材料 ? 仪器： 1、普通离心机，室温-100恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，

4、精度为 10mg级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架，离心管，试管 4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l微量可调取液器 5、100ml容量瓶 6、白瓷反应板 ? 试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂 四、实验步骤 肝糖原的提取? 鸡肝约1.5g，剪碎 COOH 入加5l3 研磨至乳状 COOH 5l加入3 研磨成肝匀浆 4000r/min）全部转入离心管中，离心3min（ 取上清液 10m

5、in 加入5ml 95%乙醇，混匀，静置 离心5min4000r/min（） 取沉淀 2ml 加入蒸馏水 2min，溶解沉淀沸水浴 糖原溶液1ml 白瓷板中 +浓HCl 0.2ml 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml +50% NaOH 0.2ml 蒸馏水 0.1ml 糖原溶液0.1ml 糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液 呈色对比0.2ml(4d) 班氏试剂+ 混匀 沸水浴2min，观察变化 注意事项： ?乙醇后，必须混匀。因上清液为95%1、提取肝糖原时：向上清液中加入等量的，加入等量4ml水溶液，密度比95%乙醇大，析出液分两层。又：上清液已多于 ，

6、混匀操作较困难，宜用倾倒混匀，或以玻棒搅拌混匀。乙醇后，总量近9ml、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有相关性。葡2个以上时碘呈蓝6020个以下时使碘呈红色，20-30个之间碘呈紫色，萄糖残基8-12（常为呈蓝色；肝糖原分枝葡萄糖残基在20个以下色。淀粉中因分支链长， 个），吸附碘后为红棕色。否则反应液呈黑色浑浊，3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量， 观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定 0.15 g 鸡肝 30% KOH 1.5ml + 沸水浴15min 冷却，全部转入100ml容量瓶中 加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液 取3支干净的试管，按下表操作：

7、 试剂（毫升） 空白管 标准管 样品管 1.0 蒸馏水标准葡萄糖溶液 1.0 1.0 糖原提取液 2.5 2.5 2.5 0.2%蒽酮溶液（） 混匀，沸水浴10min后冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算： A100100测定 =g/100g肝糖原（肝组织） 1.11 0.05 肝组织重（g）1000A标准 五、实验现象与结果讨论 鸡肝肝糖原成分的定性测定步骤简述 实验现象 鸡肝约1.5g，剪碎 肝脏碎片研磨之后呈灰黄色，两次加入试两次加入CClCOOH研磨至乳状研磨剂后均无明显变化 3成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3mi

8、n试剂分层：上层为透明无色液体，下层为（4000r/min） 灰黄色沉淀 取上清液加入95%乙醇 试剂分层，上层液体无色透明，下层为白离心5min（4000r/min） 色沉淀 取沉淀 沸水浴2min 沉淀溶解 鸡肝提取液在白瓷板中的对照显色加入糖原与碘液的一侧呈棕红色反应，对反应 照组仍为黄色 鸡肝提取液水解后加入班氏试剂再加入班氏试剂溶液为蓝色，再次水浴后，次水浴反应 溶液中产生砖红色沉淀 鸡肝肝糖原的定量测定 步骤简述 实验现象 获得白色悬浊液 0.15鸡肝克沸水浴完全配置后均为黄色溶液按要求配置三管对照溶液 获得一管黄色溶液，一管深蓝色溶液， 沸水浴一管浅黄色溶液 结果见下文 分光光度

9、计测定 具体图片见下文： ? 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，对照组则为黄色。 糖原提取液组 对照组 肝糖原定性实验中加入班氏试剂后的显色反应： 加入蒽酮溶液并且水浴过后的样品管、标准管、空白管（由左至右）? 样品管的分光光度值如测得标准管、620nm将空白管在处的A值设定为0，? 下： 样品管 标准管空白管 0.028 0.439 0 1 0.169 0 2 0.480 0.031 3 0.485 0 0.30 0.468 0 平均值(其中，样品管第二组测得数据误差较大，予以舍去) A100100测定 0.05 1.11 0.237肝糖原=（g/100g） 肝组织重（g）1000A标准 讨论： 糖原加入其中，本组在对肝糖原定性实验中都获得了较明显的反应。可以发现，碘液反应之后呈现出红棕色表明鸡肝提取液中确有糖原存在。而在糖原水解后，产物加入班氏试剂反应之后有砖红色沉淀则表明鸡肝提取液水解后获得葡萄糖，此进一步验证鸡肝中存在糖原。 在定量实验中，我组获得的数据偏低，可能原因如下： 1、在实验过程中，糖原在浓硫酸中水解不充分，获得样品管颜色偏